【摘要】：目的:利用人、小鼠卵巢癌細胞株、卵巢癌病理標本和IL-17A敲除(Knock Out,KO,IL-17A-/-)小鼠系統(tǒng)地探討外源性和內(nèi)源性IL-17A(Interleukin-17A)對卵巢癌(ovarian cancer,OVCA)脂質代謝及腹腔網(wǎng)膜轉移的影響及其作用機制,旨在為控制卵巢癌的網(wǎng)膜轉移提供新的靶點和思路。方法:1.利用Western blotting技術檢測不同濃度rh IL-17A處理不同時間對OVCAR3和A2780細胞脂肪酸代謝相關分子(FABP4,CD36,ATGL,MAGL,HSL,CPT1C)和細胞相關信號分子NF-КB和STAT3表達水平及其磷酸化水平表達的影響。同時應用Western Blotting技術檢測NF-КB抑制劑PDTC和STAT3抑制劑STATTIC分別處理OVCAR3和A2780細胞2h后,rh IL-17A對OVCAR3和A2780細胞中脂肪酸結合蛋白FABP4和細胞相關信號分子NF-КB和STAT3表達水平及其磷酸化水平表達的影響。2.利用MTS細胞增殖實驗檢測rh IL-17A和/或脂肪酸(如棕櫚酸PA)對OVCAR3和A2780細胞增殖的影響。并分別以STAT3抑制劑STATTIC、NF-КB抑制劑PDTC和FABP4抑制劑BMS309403進行相應的封閉實驗。3.利用脂肪酸轉運實驗結合油紅O染色定性和定量實驗檢測rh IL-17A和/或PA對OVCAR3和A2780細胞脂肪酸轉運的影響。并分別以STAT3抑制劑STATTIC、NF-КB抑制劑PDTC以及FABP4抑制劑BMS309403進行相應的封閉實驗。4.收集不同F(xiàn)IGO分期的上皮性卵巢癌OVCA(epithelial OVCA,EOC)臨床病理標本,采用免疫組化法檢測IL-17A和脂肪酸結合蛋白FABP4的表達,并分析IL-17A與FABP4及其與卵巢癌患者臨床分期、轉移和預后的相關性。5.利用C57BL/6野生型(wild type,WT)、IL-17A敲除小鼠和ID8細胞建立小鼠卵巢腹腔種植瘤動物模型,觀察內(nèi)源性IL-17A對小鼠卵巢腹腔內(nèi)成瘤和轉移的影響,并應用免疫組化法分析腫瘤組織中IL-17A和FABP4蛋白表達水平,應用Western Blotting技術分析內(nèi)源性IL-17A對腫瘤組織中FABP4和細胞相關信號分子STAT3表達水平及其磷酸化水平的影響。6.酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)檢測卵巢癌網(wǎng)膜富脂轉移微環(huán)境(adipocyte-rich metastatic niche)中IL-17A的主要細胞來源。結果:1.Western blotting實驗結果顯示,rh IL-17A(10ng/ml,處理24h)可顯著增加OVCAR3和A2780細胞中脂肪酸結合蛋白FABP4的表達水平和細胞相關信號分子NF-КB和STAT3的磷酸化水平(P0.05),然而對CD36,ATGL,MAGL,HSL和CPT1C蛋白表達無顯著影響(P0.05);加入NF-КB抑制劑PDTC后,rh IL-17A對OVCAR3和A2780細胞中p-NF-КB蛋白表達的促進作用顯著降低(P0.01),而對FABP4蛋白表達的促進作用無顯著影響(P0.05);加入STAT3抑制劑STATTIC后,rh IL-17A對OVCAR3和A2780細胞中p-STAT3蛋白表達和FABP4蛋白表達的促進作用顯著降低(P0.05)。2.MTS實驗結果顯示,單獨rh IL-17A和單獨PA作用均對OVCAR3和A2780細胞的增殖無顯著影響(P0.05);同時加入rh IL-17A(10ng/ml)和PA(25μM)可顯著促進OVCAR3和A2780細胞的增殖(P=0.006);STAT3抑制劑STATTIC和FABP4抑制劑BMS309403可抑制此促進作用(P0.05),NF-КB抑制劑PDTC對該促進效應沒有顯著影響(P0.05)。3.脂肪酸轉運實驗結合油紅O染色定性和定量實驗的結果顯示,單獨加入rh IL-17A和PA對OVCAR3和A2780細胞的脂肪酸轉運無顯著影響(P0.05),同時加入rh IL-17A(10ng/ml)和PA(25μM)可顯著促進OVCAR3和A2780細胞的脂肪酸轉運(P0.05)。STAT3抑制劑STATTIC和FABP4抑制劑BMS309403均可顯著抑制rh IL-17A對OVCAR3和A2780細胞脂肪酸轉運的促進作用(P0.05),然而NF-КB抑制劑PDTC對該促進效應無顯著影響(P0.05)。4.卵巢癌臨床病理組織標本分析表明,IL-17A和FABP4的表達與臨床患者的卵巢癌臨床分期(FIGO分期)、淋巴結轉移和腹水轉移等呈正相關(P0.01);IL-17A的表達強弱與FABP4的蛋白表達水平呈正相關(P0.01)。5.小鼠體內(nèi)實驗顯示,內(nèi)源性IL-17A可顯著促進小鼠卵巢腹腔內(nèi)成瘤(P=0.021)以及腫瘤組織中脂肪酸結合蛋白FABP4的表達水平(P=0.001)和細胞相關信號分子STAT3的磷酸化水平(P0.01)。WT小鼠卵巢癌組織中FABP4表達呈強陽性,IL-17-/-小鼠卵巢癌組織中FABP4表達均呈弱陽性,與WT小鼠組相比具有顯著性差異(P=0.018)。6.ELISA結果顯示,卵巢癌網(wǎng)膜富脂轉移微環(huán)境中巨噬細胞和脂肪細胞均可分泌IL-17A。結論:本研究通過人卵巢癌細胞株體外實驗、卵巢癌病理標本分析和動物體內(nèi)實驗進行研究,結果表明IL-17A可通過激活STAT3信號通路上調(diào)FABP4的表達,進而促進微環(huán)境中游離脂肪酸的攝取,為卵巢癌細胞的生長與增殖提供能量,從而促進卵巢癌網(wǎng)膜轉移灶的生長。該研究提示IL-17A和FABP4可能成為改善卵巢癌轉移的新靶點。
【圖文】：

一、外源性 IL-17A 對卵巢癌網(wǎng)膜轉移的天津醫(yī)科大學碩士學位論文 的影響及機制研究蛋白表達均無顯著性影響（P>0.05）。rhIL-17A 刺激 A2780 細胞 3h，6h，，12h，24h 可顯著性提高 FABP4 與 p-NF-КB 蛋白表達（（P<0.01），刺激 A2780 細胞 1h，3h，6h，12h，24h 可顯著性提高 p-STAT3 蛋白表達（（P<0.01），rhIL-17A刺激 OVCAR3 細胞 6h，12h，24h 可顯著性提高 FABP4 蛋白表達（P<0.01），刺激 OVCAR3 細胞 1h，3h，6h，12h，24h 可顯著性提高 p-NF-КB 蛋白表達（（P<0.01），刺激 OVCAR3 細胞 3h，6h，12h，24h 可顯著性提高 p-STAT3蛋白表達（（P<0.01）。作用 6h 與 24h 蛋白增加更顯著。表明 rhIL-17A 可促進脂肪酸結合蛋白 FABP4 的表達以及細胞相關信號分子 STAT3 與 NF-КB 磷酸化水平，但對脂質代謝相關分子無顯著性影響，為我們進一步探究 rhIL-17A促進卵巢癌網(wǎng)膜轉移的機制提供理論依據(jù)。

一、外源性 IL-17A 對卵巢癌網(wǎng)膜轉津醫(yī)科大學碩士學位論文 的影響及機制研究hIL-17A（10ng/ml）處理人卵巢癌細胞系不同時間對脂肪酸代謝相關蛋白表達和細信號通路表達水平的影響。該實驗重復 3 次。.2.2 rhIL-17A 不能通過 NF-КB 信號通路促進 FABP4 蛋白表達本次實驗我們進行了 rhIL-17A 促進 FABP4 蛋白的表達的機制研究，用 MTS 實驗檢測了 NF-КB 信號分子 705 位點 Tyr 磷酸化（p-NF-КB p制劑 PDTC 對卵巢癌細胞系 OVCAR3 和 A2780 的 IC50，結果表明（圖DTC 處理人卵巢癌細胞系 OVCAR3 和 A2780 24h 后，IC50 分別為 3.499.538μM。綜合考慮 PDTC 作用 OVCAR3 和 A2780 后，細胞存活率狀況合細胞 IC50，我們選取 0.3125μM 處理 A2780，1.25μM 處理 OVCAR3 24h。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31

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本文編號：2614731