【摘要】：背景:子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠期特發(fā)疾病,在臨床上表現(xiàn)為多種嚴(yán)重的癥狀,患者胎兒營(yíng)養(yǎng)受限,多伴有胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction,FGR),同時(shí)累及母體的多個(gè)器官、嚴(yán)重威脅著母親和胎兒的健康。子癇前期的婦女FGR的發(fā)病率比正常孕婦高2-3倍,發(fā)生時(shí)間越早,導(dǎo)致胎盤(pán)缺血及胎兒宮內(nèi)缺氧狀態(tài)越嚴(yán)重,發(fā)生FGR的危險(xiǎn)性越大,胎兒預(yù)后往往不良。臨床研究顯示,正常妊娠時(shí)孕婦外周血中循環(huán)熱休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)水平降低,且與孕周呈正相關(guān),與孕婦年齡呈負(fù)相關(guān)。而妊娠哮喘、早產(chǎn)、子癇前期、FGR等病理性妊娠中,孕婦循環(huán)中HSP70增加,提示HSP70可能與胎兒發(fā)育和妊娠期相關(guān)疾病有關(guān)。但是循環(huán)中過(guò)表達(dá)的HSP70如何誘發(fā)FGR的具體機(jī)制尚不清楚。研究人員發(fā)現(xiàn)HSP70可激發(fā)內(nèi)源性一氧化氮途徑,抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)基因轉(zhuǎn)錄及合成,降低iNOS的活性,使細(xì)胞內(nèi)一氧化氮(nitric oxide,NO)合成減少。那么,胎盤(pán)和外周血中上調(diào)表達(dá)的HSP70是否是通過(guò)影響iNOS和/或內(nèi)皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)使得相關(guān)血管的NO合成減少,進(jìn)而影響胎兒宮內(nèi)發(fā)育,還未知。因此,我們通過(guò)以下三個(gè)部分進(jìn)行研究:(1)分析外周血HSP70和NO的水平與子癇前期合并FGR疾病之間的關(guān)系;(2)建立人絨癌細(xì)胞株JEG-3細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)體系并探討不同表達(dá)水平HSP70的JEG-3細(xì)胞對(duì)HUVEC細(xì)胞的影響;(3)胎盤(pán)和外周血中HSP70蛋白表達(dá)變化對(duì)胎鼠宮內(nèi)發(fā)育的影響。通過(guò)上述3個(gè)部分的研究,證實(shí)循環(huán)中HSP70的過(guò)表達(dá)與子癇前期合并FGR相關(guān),其可能是通過(guò)影響胎兒血液循環(huán)脈管系統(tǒng)中iNOS的表達(dá),抑制內(nèi)皮細(xì)胞中NO的合成從而導(dǎo)致胎兒血供不足。本實(shí)驗(yàn)從整體和細(xì)胞水平分析循環(huán)中HSP70過(guò)表達(dá)與子癇前期合并FGR之間的關(guān)系,為臨床子癇前期合并FGR的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。目的:1.分析外周血HSP70和NO的水平,分析其與子癇前期合并FGR孕婦之間的關(guān)系。2.建立JEG-3與HUVEC共培養(yǎng)體系并探討不同表達(dá)水平HSP70的JEG-3細(xì)胞對(duì)HUVEC細(xì)胞的影響。3.通過(guò)寒冷刺激建立動(dòng)物模型,再人為誘導(dǎo)或干擾孕鼠循環(huán)中HSP70的表達(dá),探討HSP70蛋白表達(dá)變化對(duì)胎鼠宮內(nèi)發(fā)育的影響及其機(jī)制。方法:1.選取臨床診斷為子癇前期的病例,收集子癇前期(30例)、子癇前期合并FGR(25例)和正常妊娠婦女(50例)胎盤(pán)和外周血。測(cè)量外周血中HSP70和NO的水平,比較各組孕婦外周血中HSP70含量,NO水平及胎盤(pán)組織HSP70的表達(dá)變化,探討HSP70蛋白表達(dá)與子癇前期合并FGR之間的關(guān)系。2.將與胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性相近的人絨癌細(xì)胞株-JEG-3細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株-HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)于孔徑0.4μm的6孔培養(yǎng)板的Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中,觀察HUVEC細(xì)胞增值率,細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響,來(lái)探討不同水平HSP70的JEG-3細(xì)胞對(duì)HUVEC的影響,為子癇前期合并FGR的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。3.通過(guò)寒冷刺激建立子癇前期動(dòng)物模型來(lái)模擬子癇前期孕婦的病理生理特點(diǎn),同時(shí),在孕15天時(shí)通過(guò)尾靜脈注射慢病毒,至妊娠結(jié)束,觀察胎兒和胎盤(pán)的發(fā)育情況,來(lái)探討HSP70的表達(dá)變化對(duì)子癇前期胎兒的影響,為子癇前期的早期防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果:1.第一部分研究結(jié)果:子癇前期合并FGR孕婦外周血的HSP70表達(dá)與子癇前期組及正常妊娠組相比顯著升高(P0.05),子癇前期合并FGR孕婦外周血的NO(31.47±3.65μmol/L)表達(dá)與正常對(duì)照組(57.65±5.73μmol/L)相比顯著降低(P0.05)。Western blotting結(jié)果顯示,子癇前期合并FGR孕婦胎盤(pán)組織中HSP70的表達(dá)與正常對(duì)照相比明顯升高。2.第二部分研究結(jié)果:HSP70慢病毒感染JEG-3細(xì)胞后,收集細(xì)胞進(jìn)行Western blotting結(jié)果表明,與陰性病毒對(duì)照組相比,感染靶向干擾HSP70慢病毒的JEG-3細(xì)胞其HSP70的表達(dá)顯著降低(P0.05)。同時(shí),當(dāng)用Flag抗體檢測(cè)時(shí)只有過(guò)表達(dá)病毒感染細(xì)胞有條帶,改用HSP70抗體檢測(cè)后過(guò)表達(dá)組出現(xiàn)了內(nèi)源性和外源性雙條帶,這同時(shí)證明HSP70的表達(dá)顯著升高(P0.05)。這些表明,病毒感染JEG-3細(xì)胞后HSP70蛋白表達(dá)水平相應(yīng)的增加和抑制了HSP70基因的表達(dá)。HUVEC細(xì)胞在單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)呈梭型,排列成鋪路石樣外觀。共培養(yǎng)后形態(tài)未觀察到明顯變化。HUVEC細(xì)胞與HSP70低水平表達(dá)的JEG-3細(xì)胞共培養(yǎng)后,細(xì)胞內(nèi)NO含量與陰性對(duì)照組相比升高但無(wú)顯著性差異(P0.05);當(dāng)HUVEC細(xì)胞與HSP70高水平表達(dá)的JEG-3細(xì)胞共培養(yǎng)后,細(xì)胞內(nèi)NO含量與陰性對(duì)照組相比又明顯降低(P0.05)。這些結(jié)果說(shuō)明,不同HSP70表達(dá)水平的JEG-3與HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)后,能夠通過(guò)某些細(xì)胞因子影響HUVEC細(xì)胞內(nèi)NO的表達(dá);當(dāng)HSP70低水平和高水平表達(dá)的JEG-3細(xì)胞分別于HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)后,收集細(xì)胞后通過(guò)CCK-8方法檢測(cè)各組細(xì)胞增值率。我們發(fā)現(xiàn),各處理組與對(duì)照組相比,其細(xì)胞增值率均無(wú)顯著性差異。這說(shuō)明不同水平HSP70表達(dá)的JEG-3與HUVEC共培養(yǎng)后不會(huì)影響HUVEC細(xì)胞增值率。HUVEC與不同處理的JEG-3共培養(yǎng)后,通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法,經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)出各組細(xì)胞的凋亡情況。與對(duì)照組相比,共培養(yǎng)后的HUVEC細(xì)胞凋亡水平?jīng)]有明顯改變,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。這一結(jié)果說(shuō)明,HSP70表達(dá)水平改變的JEG-3與HUVEC共培養(yǎng)后不會(huì)影響HUVEC細(xì)胞凋亡水平;HUVEC與不同處理的JEG-3共培養(yǎng)后,通過(guò)PI染色法檢測(cè)各組細(xì)胞周期。與對(duì)照組相比,共培養(yǎng)后的HUVEC細(xì)胞周期沒(méi)有明顯改變,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。這一結(jié)果說(shuō)明,HSP70表達(dá)水平改變的JEG-3與HUVEC共培養(yǎng)后不會(huì)影響HUVEC的細(xì)胞周期;Western blotting結(jié)果顯示,HUVEC與HSP70低表達(dá)JEG-3細(xì)胞共培養(yǎng)后,iNOS、eNOS和HSP70蛋白水平與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。當(dāng)HUVEC與HSP70高表達(dá)JEG-3細(xì)胞共培養(yǎng)后,我們發(fā)現(xiàn)iNOS蛋白與對(duì)照組相比,表達(dá)顯著降低(P0.05),而eNOS和HSP70表達(dá)無(wú)顯著性差異。3.第三部分研究結(jié)果:各組孕鼠的胎死率和產(chǎn)仔量沒(méi)有顯著差異,雖然干擾對(duì)照和過(guò)表達(dá)對(duì)照組的活胎總數(shù)有升高的趨勢(shì),但與其它組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P0.05),這可能與孕鼠的個(gè)體差異有關(guān)。各實(shí)驗(yàn)組胎鼠身長(zhǎng)、胎盤(pán)重量的組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P0.05);HSP70干擾表達(dá)組的胎鼠體重明顯高于對(duì)照組與過(guò)表達(dá)組,且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);HSP70干擾表達(dá)組的胎盤(pán)重量低于對(duì)照組,比較差異同樣有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);4.孕鼠血漿中NO的含量比較:與正常對(duì)照組相比,寒冷刺激模型組孕鼠外周血中的NO含量明顯降低(P0.05);與干擾對(duì)照組相比,HSP70干擾表達(dá)組的孕鼠外周血中的NO含量顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而過(guò)表達(dá)組孕鼠外周血NO含量低于對(duì)照組但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。胎盤(pán)HSP70表達(dá)的比較:Western blotting結(jié)果顯示,寒冷刺激模型組與正常組相比,HSP70表達(dá)顯著升高(P0.05);干擾表達(dá)組的HSP70與對(duì)照組相比降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);過(guò)表達(dá)組與多表達(dá)對(duì)照相比顯著性升高(P0.05)。臍帶組織中eNOS和iNOS表達(dá)的比較:寒冷刺激模型組與正常組相比,eNOS和iNOS表達(dá)均顯著降低(P0.05),這與外周血中NO含量降低結(jié)果相符;干擾組中,與對(duì)照組相比,其組織中eNOS和iNOS表達(dá)均升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;過(guò)表達(dá)組中,與對(duì)照組相比,eNOS表達(dá)無(wú)明顯改變,而iNOS表達(dá)顯著降低(P0.05),這可能是由于過(guò)多的HSP70使得誘導(dǎo)型一氧氮合酶iNOS顯著降低,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞補(bǔ)償性的升高內(nèi)源性eNOS的表達(dá)。結(jié)論:1.胎盤(pán)和外周血中HSP70的水平升高很可能與子癇前期合并FGR的發(fā)病過(guò)程密切相關(guān)。2.JEG-3細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)的HSP70與HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)后能夠抑制HUVEC細(xì)胞內(nèi)iNOS的表達(dá)水平,進(jìn)而減少胞內(nèi)NO的含量。3.JEG-3細(xì)胞內(nèi)異常表達(dá)的HSP70與HUVEC細(xì)胞共培養(yǎng)后并不能改變其細(xì)胞增值率,細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期。4.寒冷刺激動(dòng)物模型中胎鼠體重與正常組相比顯著降低,且胎盤(pán)組織中HSP70表達(dá)顯著升高,臍帶組織中一氧化氮合酶表達(dá)顯著降低。5.通過(guò)抑制胎盤(pán)中的HSP70表達(dá),有助于緩解胎鼠的發(fā)育。
【圖文】：

第一部分 子癇前期合并 FGR 孕婦外周血 HSP70(HSPA1A)和 NO 的水平表 1.2 正常妊娠和子癇前期及子癇前期合并 FGR 外周血 NO 的含Tab1.2 The content of NO in each group：a,與對(duì)照組比較，P＜0.05;例數(shù)(n)外周血 NO 含量(μmol/L)正常對(duì)照 50 57.65±5.73子癇前期 10 43.56±3.45癇前期合并FGR 18 31.47±3.65a

經(jīng)超聲評(píng)估的胎兒體重低于相應(yīng)孕周應(yīng)有胎兒體重的百分位數(shù)屬于嚴(yán)重 FGR[29]。我國(guó) FGR 的發(fā)病率是 6%R 可致低出生體重、胎兒缺氧、新生兒窒息、死胎、胎響神經(jīng)行為發(fā)育，并增加代謝綜合征的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[29]。隨妊娠期高血壓疾病，，如子癇前期合并 FGR[31]。子癇盤(pán)的功能，以及胎兒的生長(zhǎng)造成影響，床上表現(xiàn)為多營(yíng)養(yǎng)受限，多伴有 FGR，嚴(yán)重威脅著母親和胎兒的健是多因素的，其中被認(rèn)可的是血管內(nèi)皮損傷學(xué)說(shuō)、遺缺血缺氧學(xué)說(shuō)和滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)異常學(xué)說(shuō)等。 Roberts[32]提出的二階段理論假說(shuō)認(rèn)為：第一階段胎圖 1.2 正常妊娠和子癇前期合并 FGR 孕婦胎盤(pán)組織中 HSP7Figure 1.2 Expression of HSP70 in placenta tissue of pregnanwith or without preeclampsia combined with FGR
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R714.244;R714.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2614382