【摘要】：背景:子癇前期(preeclampsia,PE)是一種妊娠期特發(fā)疾病,在臨床上表現為多種嚴重的癥狀,患者胎兒營養(yǎng)受限,多伴有胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR),同時累及母體的多個器官、嚴重威脅著母親和胎兒的健康。子癇前期的婦女FGR的發(fā)病率比正常孕婦高2-3倍,發(fā)生時間越早,導致胎盤缺血及胎兒宮內缺氧狀態(tài)越嚴重,發(fā)生FGR的危險性越大,胎兒預后往往不良。臨床研究顯示,正常妊娠時孕婦外周血中循環(huán)熱休克蛋白70(heat shock protein70,HSP70)水平降低,且與孕周呈正相關,與孕婦年齡呈負相關。而妊娠哮喘、早產、子癇前期、FGR等病理性妊娠中,孕婦循環(huán)中HSP70增加,提示HSP70可能與胎兒發(fā)育和妊娠期相關疾病有關。但是循環(huán)中過表達的HSP70如何誘發(fā)FGR的具體機制尚不清楚。研究人員發(fā)現HSP70可激發(fā)內源性一氧化氮途徑,抑制誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)基因轉錄及合成,降低iNOS的活性,使細胞內一氧化氮(nitric oxide,NO)合成減少。那么,胎盤和外周血中上調表達的HSP70是否是通過影響iNOS和/或內皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)使得相關血管的NO合成減少,進而影響胎兒宮內發(fā)育,還未知。因此,我們通過以下三個部分進行研究:(1)分析外周血HSP70和NO的水平與子癇前期合并FGR疾病之間的關系;(2)建立人絨癌細胞株JEG-3細胞與人臍靜脈內皮細胞株HUVEC細胞共培養(yǎng)體系并探討不同表達水平HSP70的JEG-3細胞對HUVEC細胞的影響;(3)胎盤和外周血中HSP70蛋白表達變化對胎鼠宮內發(fā)育的影響。通過上述3個部分的研究,證實循環(huán)中HSP70的過表達與子癇前期合并FGR相關,其可能是通過影響胎兒血液循環(huán)脈管系統(tǒng)中iNOS的表達,抑制內皮細胞中NO的合成從而導致胎兒血供不足。本實驗從整體和細胞水平分析循環(huán)中HSP70過表達與子癇前期合并FGR之間的關系,為臨床子癇前期合并FGR的防治提供實驗依據。目的:1.分析外周血HSP70和NO的水平,分析其與子癇前期合并FGR孕婦之間的關系。2.建立JEG-3與HUVEC共培養(yǎng)體系并探討不同表達水平HSP70的JEG-3細胞對HUVEC細胞的影響。3.通過寒冷刺激建立動物模型,再人為誘導或干擾孕鼠循環(huán)中HSP70的表達,探討HSP70蛋白表達變化對胎鼠宮內發(fā)育的影響及其機制。方法:1.選取臨床診斷為子癇前期的病例,收集子癇前期(30例)、子癇前期合并FGR(25例)和正常妊娠婦女(50例)胎盤和外周血。測量外周血中HSP70和NO的水平,比較各組孕婦外周血中HSP70含量,NO水平及胎盤組織HSP70的表達變化,探討HSP70蛋白表達與子癇前期合并FGR之間的關系。2.將與胎盤滋養(yǎng)細胞生物學特性相近的人絨癌細胞株-JEG-3細胞與人臍靜脈內皮細胞株-HUVEC細胞共培養(yǎng)于孔徑0.4μm的6孔培養(yǎng)板的Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中,觀察HUVEC細胞增值率,細胞凋亡及細胞周期的影響,來探討不同水平HSP70的JEG-3細胞對HUVEC的影響,為子癇前期合并FGR的發(fā)病機制提供實驗理論依據。3.通過寒冷刺激建立子癇前期動物模型來模擬子癇前期孕婦的病理生理特點,同時,在孕15天時通過尾靜脈注射慢病毒,至妊娠結束,觀察胎兒和胎盤的發(fā)育情況,來探討HSP70的表達變化對子癇前期胎兒的影響,為子癇前期的早期防治提供實驗依據。結果:1.第一部分研究結果:子癇前期合并FGR孕婦外周血的HSP70表達與子癇前期組及正常妊娠組相比顯著升高(P0.05),子癇前期合并FGR孕婦外周血的NO(31.47±3.65μmol/L)表達與正常對照組(57.65±5.73μmol/L)相比顯著降低(P0.05)。Western blotting結果顯示,子癇前期合并FGR孕婦胎盤組織中HSP70的表達與正常對照相比明顯升高。2.第二部分研究結果:HSP70慢病毒感染JEG-3細胞后,收集細胞進行Western blotting結果表明,與陰性病毒對照組相比,感染靶向干擾HSP70慢病毒的JEG-3細胞其HSP70的表達顯著降低(P0.05)。同時,當用Flag抗體檢測時只有過表達病毒感染細胞有條帶,改用HSP70抗體檢測后過表達組出現了內源性和外源性雙條帶,這同時證明HSP70的表達顯著升高(P0.05)。這些表明,病毒感染JEG-3細胞后HSP70蛋白表達水平相應的增加和抑制了HSP70基因的表達。HUVEC細胞在單獨培養(yǎng)時呈梭型,排列成鋪路石樣外觀。共培養(yǎng)后形態(tài)未觀察到明顯變化。HUVEC細胞與HSP70低水平表達的JEG-3細胞共培養(yǎng)后,細胞內NO含量與陰性對照組相比升高但無顯著性差異(P0.05);當HUVEC細胞與HSP70高水平表達的JEG-3細胞共培養(yǎng)后,細胞內NO含量與陰性對照組相比又明顯降低(P0.05)。這些結果說明,不同HSP70表達水平的JEG-3與HUVEC細胞共培養(yǎng)后,能夠通過某些細胞因子影響HUVEC細胞內NO的表達;當HSP70低水平和高水平表達的JEG-3細胞分別于HUVEC細胞共培養(yǎng)后,收集細胞后通過CCK-8方法檢測各組細胞增值率。我們發(fā)現,各處理組與對照組相比,其細胞增值率均無顯著性差異。這說明不同水平HSP70表達的JEG-3與HUVEC共培養(yǎng)后不會影響HUVEC細胞增值率。HUVEC與不同處理的JEG-3共培養(yǎng)后,通過Annexin V-FITC/PI雙標法,經過流式細胞術可以檢測出各組細胞的凋亡情況。與對照組相比,共培養(yǎng)后的HUVEC細胞凋亡水平沒有明顯改變,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。這一結果說明,HSP70表達水平改變的JEG-3與HUVEC共培養(yǎng)后不會影響HUVEC細胞凋亡水平;HUVEC與不同處理的JEG-3共培養(yǎng)后,通過PI染色法檢測各組細胞周期。與對照組相比,共培養(yǎng)后的HUVEC細胞周期沒有明顯改變,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。這一結果說明,HSP70表達水平改變的JEG-3與HUVEC共培養(yǎng)后不會影響HUVEC的細胞周期;Western blotting結果顯示,HUVEC與HSP70低表達JEG-3細胞共培養(yǎng)后,iNOS、eNOS和HSP70蛋白水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。當HUVEC與HSP70高表達JEG-3細胞共培養(yǎng)后,我們發(fā)現iNOS蛋白與對照組相比,表達顯著降低(P0.05),而eNOS和HSP70表達無顯著性差異。3.第三部分研究結果:各組孕鼠的胎死率和產仔量沒有顯著差異,雖然干擾對照和過表達對照組的活胎總數有升高的趨勢,但與其它組相比無統(tǒng)計學差異(均P0.05),這可能與孕鼠的個體差異有關。各實驗組胎鼠身長、胎盤重量的組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P0.05);HSP70干擾表達組的胎鼠體重明顯高于對照組與過表達組,且差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);HSP70干擾表達組的胎盤重量低于對照組,比較差異同樣有統(tǒng)計學意義(P0.05);4.孕鼠血漿中NO的含量比較:與正常對照組相比,寒冷刺激模型組孕鼠外周血中的NO含量明顯降低(P0.05);與干擾對照組相比,HSP70干擾表達組的孕鼠外周血中的NO含量顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);而過表達組孕鼠外周血NO含量低于對照組但差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。胎盤HSP70表達的比較:Western blotting結果顯示,寒冷刺激模型組與正常組相比,HSP70表達顯著升高(P0.05);干擾表達組的HSP70與對照組相比降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);過表達組與多表達對照相比顯著性升高(P0.05)。臍帶組織中eNOS和iNOS表達的比較:寒冷刺激模型組與正常組相比,eNOS和iNOS表達均顯著降低(P0.05),這與外周血中NO含量降低結果相符;干擾組中,與對照組相比,其組織中eNOS和iNOS表達均升高,差異具有統(tǒng)計學意義;過表達組中,與對照組相比,eNOS表達無明顯改變,而iNOS表達顯著降低(P0.05),這可能是由于過多的HSP70使得誘導型一氧氮合酶iNOS顯著降低,導致內皮細胞補償性的升高內源性eNOS的表達。結論:1.胎盤和外周血中HSP70的水平升高很可能與子癇前期合并FGR的發(fā)病過程密切相關。2.JEG-3細胞內過表達的HSP70與HUVEC細胞共培養(yǎng)后能夠抑制HUVEC細胞內iNOS的表達水平,進而減少胞內NO的含量。3.JEG-3細胞內異常表達的HSP70與HUVEC細胞共培養(yǎng)后并不能改變其細胞增值率,細胞凋亡及細胞周期。4.寒冷刺激動物模型中胎鼠體重與正常組相比顯著降低,且胎盤組織中HSP70表達顯著升高,臍帶組織中一氧化氮合酶表達顯著降低。5.通過抑制胎盤中的HSP70表達,有助于緩解胎鼠的發(fā)育。
【圖文】：

第一部分 子癇前期合并 FGR 孕婦外周血 HSP70(HSPA1A)和 NO 的水平表 1.2 正常妊娠和子癇前期及子癇前期合并 FGR 外周血 NO 的含Tab1.2 The content of NO in each group：a,與對照組比較，P＜0.05;例數(n)外周血 NO 含量(μmol/L)正常對照 50 57.65±5.73子癇前期 10 43.56±3.45癇前期合并FGR 18 31.47±3.65a

經超聲評估的胎兒體重低于相應孕周應有胎兒體重的百分位數屬于嚴重 FGR[29]。我國 FGR 的發(fā)病率是 6%R 可致低出生體重、胎兒缺氧、新生兒窒息、死胎、胎響神經行為發(fā)育，并增加代謝綜合征的發(fā)生風險[29]。隨妊娠期高血壓疾病，，如子癇前期合并 FGR[31]。子癇盤的功能，以及胎兒的生長造成影響，床上表現為多營養(yǎng)受限，多伴有 FGR，嚴重威脅著母親和胎兒的健是多因素的，其中被認可的是血管內皮損傷學說、遺缺血缺氧學說和滋養(yǎng)細胞凋亡調節(jié)異常學說等。 Roberts[32]提出的二階段理論假說認為：第一階段胎圖 1.2 正常妊娠和子癇前期合并 FGR 孕婦胎盤組織中 HSP7Figure 1.2 Expression of HSP70 in placenta tissue of pregnanwith or without preeclampsia combined with FGR
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R714.244;R714.5

【參考文獻】

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本文編號：2614382