發(fā)布時間：2020-04-03 01:45

【摘要】：唐氏綜合征(Down syndrome,DS)即21三體,是導致智力障礙的最主要遺傳因素之一,由21號染色體先天存在的額外拷貝引起。已有研究證實DS患者海馬體中通過非編碼RNA等作用介導的表觀遺傳學改變參與了DS導致的認知障礙。最近,一類新的非編碼RNA分子--環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)受到了廣泛的關(guān)注,circRNA具有多種分子功能,表達具有組織特異性,且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有明顯富集。在神經(jīng)元發(fā)育過程中,circRNA的表達受到了突觸可塑性的調(diào)節(jié),提示其具有特定的調(diào)控功能。目前DS胎兒大腦海馬區(qū)的circRNA表達情況和潛在作用尚無報道。目的本研究擬采用基因芯片技術(shù)對唐氏綜合征胎兒和正常二倍體胎兒大腦海馬區(qū)差異性表達的circRNA進行篩選,并結(jié)合已報道的相同組織中差異表達的miRNA,mRNA數(shù)據(jù),對circRNA與miRNA,mRNA進行關(guān)聯(lián)分析和功能分析,為進一步研究circRNA在DS發(fā)生發(fā)展中的作用機制奠定基礎(chǔ)。方法1.使用TRIzoI法提取海馬組織總RNA,加入RNase-free水獲得的RNA溶液用NanoDrop ND-2000測定產(chǎn)率和純度,合格后于-80℃凍存。2.將RNA反轉(zhuǎn)錄得到First Strand cDNA及Second Strand cDNA,以Second Strand cDNA為模板合成cRNA并進行反轉(zhuǎn)錄,回收反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進行熒光標記反應,帶有熒光基團的DNA即可用于芯片雜交,雜交結(jié)束后進行芯片清洗及掃描得到雜交圖。3.使用Feature Extraction軟件對雜交圖片進行分析并提取數(shù)據(jù),Agilent GeneSpring GX軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析。CircRNA差異表達標準為變化倍數(shù)(fold change,FC)32.0和校正后P值0.05,差異表達circRNA數(shù)據(jù)需進行監(jiān)督性層次聚類分析。使用WebGestalt對差異表達circRNA的親本基因進行途徑和疾病內(nèi)容的富集分析,miRanda和miRWalk2預測網(wǎng)站結(jié)合已報道的DS胎兒海馬區(qū)miRNA和mRNA表達譜數(shù)據(jù)進行circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控通路分析。4.對部分差異表達circRNA(hsa_circ_0137595;hsa_circ_0095640;hsa_circ_0137679;hsa_circ_0073296;hsa_circ_0023500;hsa_circ_0115770;hsa_circ_0115774;hsa_circ_0115775)進行qRT-PCR實驗驗證,并將驗證結(jié)果與circRNA芯片數(shù)據(jù)進行比較。結(jié)果1.CircRNA在DS胎兒海馬樣本中具有差異性表達變化(FC32.0,校正后P0.05)。2.差異表達circRNA可能起到miRNA海綿的作用,進而調(diào)節(jié)DS神經(jīng)病癥相關(guān)的miRNA水平。3.對DE circRNA親本基因的分析顯示DE circRNA與突觸小泡循環(huán),軸突導向,長時程增強(LTP)和長期抑制(LTD)等許多神經(jīng)生物學途徑相關(guān),這些途徑可能導致DS患者出現(xiàn)學習和記憶缺陷,智能障礙以及早發(fā)性阿爾茨海默病等異常表型。4.GRIK1來源的三種DE circRNA(hsa_circRNA_0115770,hsa_circRNA_0115774和hsa_circRNA_0115775)的最終靶基因涉及軸突導向,MAPK信號傳導,磷脂酰肌醇信號傳導,神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)信號傳導等多種神經(jīng)發(fā)病機制有關(guān)的途徑。結(jié)論CircRNA在DS胎兒海馬樣本中具有差異性表達變化。經(jīng)預測部分DE circRNA可以調(diào)節(jié)DS神經(jīng)病癥相關(guān)的miRNA水平,DE circRNA的親本基因以及GRIK1來源的三種Circ-GRIK1的最終靶基因經(jīng)分析均顯示其與許多神經(jīng)生物學途徑相關(guān),這些作用可能導致了DS患者智能障礙等異常表型的發(fā)生。我們的研究結(jié)果為進一步闡明DE circRNA在DS患者的慢性神經(jīng)退行性疾病或智力障礙中潛在的分子生物學功能提供了重要依據(jù)。
【圖文】：

結(jié) 果3 結(jié)果3.1 唐氏綜合征海馬體 circRNA 差異表達分析3.1.1 circRNA 芯片掃描圖共完成14 個樣品的circRNA芯片，獲得DS組織芯片檢測圖8張 (記為DS1,DS2, DS3, DS4, DS5, DS6, DS7, DS8)，二倍體對照組織芯片檢測圖 6 張(記為CON1, CON2, CON3, CON4，CON5, CON6)。各組芯片檢測圖的探針熒光信號均勻清晰，，整體背景強度低，無刮擦痕跡及水漬，芯片掃描檢測圖見圖 3.1。

結(jié) 果張。3.1.2 circRNA 芯片質(zhì)控結(jié)果對樣本芯片探針熒光信號數(shù)據(jù)和分位數(shù)進行歸一化處理后繪制箱線圖（boxplot），展示了不同樣本歸一化處理后的總體表達情況。在 14 張芯片中（8 例唐氏組織 DS1, DS2, DS3, DS4, DS5, DS6, DS7, DS8；6 例二倍體對照組織 CON1,CON2, CON3, CON4，CON5, CON6），circRNAs 表達譜歸一化后不同樣本總體熒光信號強度趨于同一水平，見圖 3.2。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R714.5

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本文編號：2612755