【摘要】：宮頸癌是全球女性中僅次于乳腺癌的第二大惡性腫瘤,宮頸癌高發(fā)年齡一般為30~55周歲,近年來(lái)其發(fā)病有年輕化的趨勢(shì)。溶瘤腺病毒是非常有前途的癌癥基因治療藥物,因?yàn)樗鼈兙哂性趷盒阅[瘤細(xì)胞中選擇性復(fù)制的特點(diǎn),能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞的溶解和炎癥,本研究使用的重組溶瘤腺病毒Ad-VT是本實(shí)驗(yàn)室~([1])基于凋亡素基因Apoptin,腫瘤特異性啟動(dòng)子hTERTp,病毒復(fù)制必須基因E1A通過(guò)RAPAd.I腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建而成的具有腫瘤特異性復(fù)制和腫瘤特異性殺傷能力的溶瘤腺病毒。本實(shí)驗(yàn)室大量前期研究表明~([2-4]),Ad-VT構(gòu)建方式可靠,能夠穩(wěn)定表達(dá)并且療效顯著,對(duì)胃癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、結(jié)直腸癌和前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞均具有顯著的抑制作用,對(duì)正常的人體細(xì)胞無(wú)影響。前期研究表明Ad-VT完全具備進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的條件。目的:探究重組溶瘤腺病毒對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的抑制作用以及重組溶瘤腺病毒對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響;進(jìn)一步探究重組溶瘤腺病毒通過(guò)哪些途徑誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡;最后重點(diǎn)研究Hela細(xì)胞線粒體凋亡途徑。通過(guò)該研究對(duì)重組溶瘤腺病毒誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡途徑進(jìn)行初步認(rèn)識(shí)。方法:1 Hela細(xì)胞線粒體提取與功能活性驗(yàn)證通過(guò)Minute線粒體分離試劑盒提取Hela細(xì)胞線粒體;通過(guò)Western Blot法檢測(cè)提取出線粒體中線粒體內(nèi)參蛋白COXⅣ水平從而驗(yàn)證線粒體純度;通過(guò)檢測(cè)提取出線粒體的ATP水平和活性氧水平驗(yàn)證線粒體的功能活性。2重組溶瘤腺病毒對(duì)Hela細(xì)胞抑制途徑研究通過(guò)CCK-8法和乳酸脫氫酶釋放實(shí)驗(yàn)明確重組溶瘤腺病毒對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用;通過(guò)Hoechst染色和AnnexinⅤ-FITC/PI流式檢測(cè)探究重組溶瘤腺病毒對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響;通過(guò)Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)和Biocoat小室侵襲實(shí)驗(yàn)探究重組溶瘤腺病毒對(duì)Hela細(xì)胞遷移和侵襲的影響;通過(guò)Western Blot法進(jìn)行凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè),初步研究重組溶瘤腺病毒誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的途徑。3重組溶瘤腺病毒通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡通過(guò)JC-1染色及JC-1流式檢測(cè)探究重組溶瘤腺病毒對(duì)Hela細(xì)胞線粒體膜電位的影響;通過(guò)Minute線粒體分離試劑盒提取感染重組溶瘤腺病毒后的Hela細(xì)胞線粒體;通過(guò)對(duì)提取出的線粒體進(jìn)行ATP和活性氧檢測(cè)探究重組溶瘤腺病毒對(duì)Hela細(xì)胞線粒體功能活性的影響;通過(guò)Western Blot法檢測(cè)線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá),初步研究重組溶瘤腺病毒誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的線粒體途徑。結(jié)果:1通過(guò)Minute線粒體分離試劑盒成功提取出了純度較高且具有較好功能活性的線粒體。2通過(guò)CCK-8和乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn),明確重組溶瘤腺病毒能夠?qū)ela細(xì)胞起到抑制作用且該抑制作用具有顯著時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng),重組溶瘤腺病毒對(duì)Hela細(xì)胞抑制率依次為:Ad-VTAd-TAd-Vp3Ad-Mock;通過(guò)Hoechst染色和AnnexinⅤ-FITC/PI流式檢測(cè)明確重組溶瘤腺病毒通過(guò)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡對(duì)其產(chǎn)生抑制作用,且4種重組溶瘤腺病毒誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的能力依次為:Ad-VTAd-TAd-Vp3Ad-Mock;通過(guò)Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)和Biocoat小室侵襲實(shí)驗(yàn)確定重組溶瘤腺病毒能夠影響Hela細(xì)胞遷移和侵襲能力,且影響程度依次為:Ad-VTAd-TAd-Vp3Ad-Mock;通過(guò)Western Blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白明確重組溶瘤腺病毒能夠影響多種Hela細(xì)胞凋亡途徑蛋白,從而對(duì)Hela細(xì)胞的凋亡起調(diào)控作用。3通過(guò)JC-1染色明確重組溶瘤腺病毒可以使Hela細(xì)胞線粒體膜電位降低,誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生早期凋亡,通過(guò)JC-1流式明確重組溶瘤腺病毒誘導(dǎo)Hela細(xì)胞早期凋亡具有顯著的時(shí)間效應(yīng),且4種重組溶瘤腺病毒誘導(dǎo)Hela細(xì)胞早期凋亡的能力依次為:Ad-VTAd-TAd-Vp3Ad-Mock;通過(guò)ATP和活性氧檢測(cè)明確重組溶瘤腺病毒對(duì)Hela細(xì)胞線粒體的功能活性具有顯著影響;通過(guò)Western Blot法初步明確重組溶瘤腺病毒通過(guò)調(diào)控AIF、Arts等線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。結(jié)論:重組溶瘤腺病毒能夠通過(guò)誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡對(duì)其起抑制作用;并且它可以通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)Hela細(xì)胞發(fā)生凋亡;其中最重要的途徑是線粒體途徑,重組溶瘤腺病毒通過(guò)影響線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)調(diào)控Hela細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

藥大學(xué) 2019 屆碩士學(xué)位論文文獻(xiàn)綜述腺病毒簡(jiǎn)介瘤腺病毒為無(wú)包膜病毒，一般具有二十面體衣殼結(jié)構(gòu)，腺病毒由圖主要衣殼蛋白和 4 種次要衣殼蛋白組成。六鄰體蛋白是腺病毒中最白，包含十二面體病毒衣殼的 20 個(gè)面。如圖 1 所示，在每個(gè)頂點(diǎn)體蛋白基底，纖維蛋白從中伸出。纖維蛋白由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分，作用是將蛋白質(zhì)錨定在衣殼上；遠(yuǎn)端球狀旋鈕區(qū)，作用是識(shí)別并；纖維軸區(qū)，作用是使旋鈕遠(yuǎn)離衣殼，從而避免病毒與細(xì)胞相互作排斥作用。

圖 2 細(xì)胞凋亡通路Fig.2 Cell apoptotic pathway粒體凋亡途徑啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的內(nèi)在信號(hào)傳導(dǎo)途徑涉及多種非受體介導(dǎo)的刺激，，這些刺且直接作用于細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo),產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行正向或負(fù)向刺激能夠引起線粒體內(nèi)膜的變化,導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換（MPT）孔的開(kāi)線粒體跨膜電位的喪失和兩組主要促凋亡蛋白從線粒體膜間隙釋放到[118]。第一組促凋亡蛋白由細(xì)胞色 C，Smac / DIABLO 和絲氨酸蛋白酶 i 組成[119,120]。這些促凋亡蛋白可以激活 caspase 依賴型線粒體途徑。細(xì) 結(jié)合并激活 Apaf-1 以及 caspase-9 前體，形成“凋亡小體”[121,122]。據(jù)報(bào)c / DIABLO 和 HtrA2 / Omi 通過(guò)抑制凋亡蛋白抑制劑（IAP）活性來(lái)促
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：2611477