【摘要】：宮頸癌是全球女性中僅次于乳腺癌的第二大惡性腫瘤,宮頸癌高發(fā)年齡一般為30~55周歲,近年來其發(fā)病有年輕化的趨勢。溶瘤腺病毒是非常有前途的癌癥基因治療藥物,因為它們具有在惡性腫瘤細胞中選擇性復制的特點,能夠導致腫瘤細胞的溶解和炎癥,本研究使用的重組溶瘤腺病毒Ad-VT是本實驗室~([1])基于凋亡素基因Apoptin,腫瘤特異性啟動子hTERTp,病毒復制必須基因E1A通過RAPAd.I腺病毒載體系統(tǒng)構建而成的具有腫瘤特異性復制和腫瘤特異性殺傷能力的溶瘤腺病毒。本實驗室大量前期研究表明~([2-4]),Ad-VT構建方式可靠,能夠穩(wěn)定表達并且療效顯著,對胃癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、結直腸癌和前列腺癌等多種腫瘤細胞均具有顯著的抑制作用,對正常的人體細胞無影響。前期研究表明Ad-VT完全具備進行后續(xù)實驗的條件。目的:探究重組溶瘤腺病毒對人宮頸癌Hela細胞的抑制作用以及重組溶瘤腺病毒對Hela細胞凋亡的影響;進一步探究重組溶瘤腺病毒通過哪些途徑誘導Hela細胞凋亡;最后重點研究Hela細胞線粒體凋亡途徑。通過該研究對重組溶瘤腺病毒誘導腫瘤細胞凋亡途徑進行初步認識。方法:1 Hela細胞線粒體提取與功能活性驗證通過Minute線粒體分離試劑盒提取Hela細胞線粒體;通過Western Blot法檢測提取出線粒體中線粒體內參蛋白COXⅣ水平從而驗證線粒體純度;通過檢測提取出線粒體的ATP水平和活性氧水平驗證線粒體的功能活性。2重組溶瘤腺病毒對Hela細胞抑制途徑研究通過CCK-8法和乳酸脫氫酶釋放實驗明確重組溶瘤腺病毒對Hela細胞的抑制作用;通過Hoechst染色和AnnexinⅤ-FITC/PI流式檢測探究重組溶瘤腺病毒對Hela細胞凋亡的影響;通過Transwell小室遷移實驗和Biocoat小室侵襲實驗探究重組溶瘤腺病毒對Hela細胞遷移和侵襲的影響;通過Western Blot法進行凋亡相關蛋白檢測,初步研究重組溶瘤腺病毒誘導Hela細胞凋亡的途徑。3重組溶瘤腺病毒通過線粒體途徑誘導Hela細胞凋亡通過JC-1染色及JC-1流式檢測探究重組溶瘤腺病毒對Hela細胞線粒體膜電位的影響;通過Minute線粒體分離試劑盒提取感染重組溶瘤腺病毒后的Hela細胞線粒體;通過對提取出的線粒體進行ATP和活性氧檢測探究重組溶瘤腺病毒對Hela細胞線粒體功能活性的影響;通過Western Blot法檢測線粒體凋亡途徑相關蛋白的表達,初步研究重組溶瘤腺病毒誘導Hela細胞凋亡的線粒體途徑。結果:1通過Minute線粒體分離試劑盒成功提取出了純度較高且具有較好功能活性的線粒體。2通過CCK-8和乳酸脫氫酶釋放試驗,明確重組溶瘤腺病毒能夠對Hela細胞起到抑制作用且該抑制作用具有顯著時間效應和劑量效應,重組溶瘤腺病毒對Hela細胞抑制率依次為:Ad-VTAd-TAd-Vp3Ad-Mock;通過Hoechst染色和AnnexinⅤ-FITC/PI流式檢測明確重組溶瘤腺病毒通過誘導Hela細胞凋亡對其產生抑制作用,且4種重組溶瘤腺病毒誘導Hela細胞凋亡的能力依次為:Ad-VTAd-TAd-Vp3Ad-Mock;通過Transwell小室遷移實驗和Biocoat小室侵襲實驗確定重組溶瘤腺病毒能夠影響Hela細胞遷移和侵襲能力,且影響程度依次為:Ad-VTAd-TAd-Vp3Ad-Mock;通過Western Blot法檢測凋亡相關蛋白明確重組溶瘤腺病毒能夠影響多種Hela細胞凋亡途徑蛋白,從而對Hela細胞的凋亡起調控作用。3通過JC-1染色明確重組溶瘤腺病毒可以使Hela細胞線粒體膜電位降低,誘導Hela細胞發(fā)生早期凋亡,通過JC-1流式明確重組溶瘤腺病毒誘導Hela細胞早期凋亡具有顯著的時間效應,且4種重組溶瘤腺病毒誘導Hela細胞早期凋亡的能力依次為:Ad-VTAd-TAd-Vp3Ad-Mock;通過ATP和活性氧檢測明確重組溶瘤腺病毒對Hela細胞線粒體的功能活性具有顯著影響;通過Western Blot法初步明確重組溶瘤腺病毒通過調控AIF、Arts等線粒體凋亡途徑相關蛋白誘導Hela細胞凋亡。結論:重組溶瘤腺病毒能夠通過誘導Hela細胞凋亡對其起抑制作用;并且它可以通過多種途徑誘導Hela細胞發(fā)生凋亡;其中最重要的途徑是線粒體途徑,重組溶瘤腺病毒通過影響線粒體凋亡途徑相關蛋白的表達調控Hela細胞凋亡。
【圖文】：

藥大學 2019 屆碩士學位論文文獻綜述腺病毒簡介瘤腺病毒為無包膜病毒，一般具有二十面體衣殼結構，腺病毒由圖主要衣殼蛋白和 4 種次要衣殼蛋白組成。六鄰體蛋白是腺病毒中最白，包含十二面體病毒衣殼的 20 個面。如圖 1 所示，在每個頂點體蛋白基底，纖維蛋白從中伸出。纖維蛋白由三個結構域組成，分，作用是將蛋白質錨定在衣殼上；遠端球狀旋鈕區(qū)，作用是識別并；纖維軸區(qū)，作用是使旋鈕遠離衣殼，從而避免病毒與細胞相互作排斥作用。

圖 2 細胞凋亡通路Fig.2 Cell apoptotic pathway粒體凋亡途徑啟動細胞凋亡的內在信號傳導途徑涉及多種非受體介導的刺激，，這些刺且直接作用于細胞內靶標,產生細胞內信號，對細胞進行正向或負向刺激能夠引起線粒體內膜的變化,導致線粒體通透性轉換（MPT）孔的開線粒體跨膜電位的喪失和兩組主要促凋亡蛋白從線粒體膜間隙釋放到[118]。第一組促凋亡蛋白由細胞色 C，Smac / DIABLO 和絲氨酸蛋白酶 i 組成[119,120]。這些促凋亡蛋白可以激活 caspase 依賴型線粒體途徑。細 結合并激活 Apaf-1 以及 caspase-9 前體，形成“凋亡小體”[121,122]。據報c / DIABLO 和 HtrA2 / Omi 通過抑制凋亡蛋白抑制劑（IAP）活性來促
【學位授予單位】：長春中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.33

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本文編號：2611477