【摘要】：背景與目的卵巢癌缺乏有效的早期診治方法,患者大多預后不良,高級別漿液性卵巢癌(high grade serous ovarian cancer，HGSOC)惡性度較其他腫瘤類型高。盡管近年在HGSOC研究和治療方面取得了顯著進展,但HGSOC潛在分子發(fā)病機制仍有待進一步探索。類固醇-5α還原酶3(steroid-5a redutase3,SRD5A3)屬于類固醇-5a還原酶家族中的一員,SRD5A3表達水平的上調(diào)與人類腫瘤表現(xiàn)惡性生物學行為之間存在一定的相關性。然而,SRD5A3在高級別漿液性卵巢癌中的表達水平及其發(fā)揮的生物學作用尚未完全闡明。該實驗探究了SRD5A3在HGSOC組織及細胞系的表達與在正常輸卵管傘組織及細胞系中的表達水平差異,并分析了 SRD5A3表達水平與HGSOC患者不良預后之間的關系,通過上調(diào)或者下調(diào)SRD5A3表達研究SRD5A3對HGSOC生物學行為的影響,探索其作為HGSOC患者預后標志物的潛力,及基因靶向治療靶點的可能性。材料與方法通過實時定量PCR(RT-qPCR)及Western印跡(WB)分析SRD5A3在正常對照和癌組織中的表達。采用免疫組化技術分析SRD5A3在FT和HGSOC中的蛋白水平差異及SRD5A3表達水平與HGSOC患者生存期及臨床生化特征之間的相關性。構建SRD5A3過表達及干擾表達的質(zhì)粒,利用慢病毒感染技術建立過表達及干擾表達的穩(wěn)定細胞。MTT及克隆形成實驗用于研究SRD5A3對卵巢癌細胞生長和增殖的影響,Transwell實驗用于研究SRD5A3在卵巢癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的生物學作用。將一定濃度梯度的順鉑和SRD5A3小分子抑制劑應用于卵巢癌細胞,分析SRD5A3與卵巢癌細胞順鉑化療耐藥的關系,并通過MTT法檢測順鉑和SRD5A3小分子抑制劑聯(lián)合應用對順鉑治療卵巢癌出現(xiàn)的化療耐藥的影響。研究結(jié)果HGSOC組織中SRD5A3的mRNA及蛋白表達水平顯著高于FT組織;在HGSOC患者中SRD5A3高表達組的存活時間較SRD5A3低表達組短,且SRD5A3表達水平與HGSOC患者鉑類化療耐藥、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間具有相關性。SRD5A3表達上調(diào)后,卵巢癌細胞生長速度加快,克隆形成能力增強,周期檢測結(jié)果表明過表達SRD5A3會促進卵巢癌細胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化,下調(diào)SRD5A3表達會導致卵巢癌細胞周期阻滯在G0/G1期;RT-PCR技術檢測細胞周期相關分子mRNA水平結(jié)果表明,SRD5A3過表達后,A2780細胞系C-MYC,CDK2，CCNE1,CDK4，CDK6，CCND1 水平升高,P21,P27水平降低;SRD5A3干擾后結(jié)果相反;利用WB技術發(fā)現(xiàn)上述分子蛋白水平發(fā)生相應改變。遷移和侵襲實驗表明,SRD5A3表達上調(diào)促進卵巢癌細胞穿越至Transwell小室下室;干擾SRD5A3后,結(jié)果相反;采用RT-PCR技術檢測EMT相關分子及EMT相關轉(zhuǎn)錄因子的mRNA水平,SRD5A3過表達后上皮性標志分子E-cadherin水平降低,而間質(zhì)性分子N-cadherin,vimentin,ZEB1水平升高,SRD5A3干擾后結(jié)果相反;利用Western Blot檢測EMT相關分子及EMT相關轉(zhuǎn)錄因子的蛋白水平,SRD5A3過表達后上皮性分子E-cadherin表達下調(diào),而間質(zhì)分子N-cadherin,vimentin,ZEB1表達明顯上調(diào),SRD5A3干擾后結(jié)果相反。RT-PCR顯示增加順鉑作用濃度,SRD5A3的mRNA水平增加;Western blot顯示延長順鉑作用時間,SRD5A3的蛋白水平增加,而且上調(diào)SRD5A3的表達,自噬相關分子Atg12及LC3 I/II的蛋白水平增加,P62的蛋白水平減少,敲低SRD5A3的表達,結(jié)果相反;藥物MTT實驗顯示增加小分子抑制劑作用濃度和作用時間,卵巢癌細胞的生長抑制率增加;耐藥MTT實驗顯示增加順鉑作用濃度,SRD5A3干擾的卵巢癌細胞系細胞抑制率較對照對增加;將順鉑與小分子抑制劑聯(lián)合應用對卵巢癌細胞的抑制作用強于將順鉑或小分子抑制劑單獨應用。SRD5A3過表達后P13K，p-AKT，p-mTOR的蛋白水平升高,SRD5A3 干擾后P13K，p-AKT,p-mTOR的蛋白水平降低。研究結(jié)論1.SRD5A3在HGSOC中高表達,且其表達水平與HGSOC患者不良預后、鉑類化療耐藥及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關;2.SRD5A3通過調(diào)節(jié)卵巢癌細胞周期來增強卵巢癌細胞的生長和增殖;3.SRD5A3通過調(diào)節(jié)EMT相關分子的表達誘導卵巢癌細胞發(fā)生EMT,從而促進卵巢癌細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移;4.SRD5A3通過促進卵巢癌細胞的自噬參與鉑類化療耐藥;5.降低SRD5A3表達或者使用SRD5A3的小分子抑制劑可以增強順鉑化療的敏感性;6.SRD5A3在卵巢癌中起的生物學功能伴有P13K/AKT/mTOR通路激活。因此,SRD5A3可能是潛在的HGSOC患者生存預后的標志物和其治療的靶點。
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ＲＮＡ及蛋白質(zhì)，通過ＷＢ實驗分析了邋ＳＲＤ５Ａ３在６例ＦＴ組織和１０例ＨＧＳＯＣ組逡逑織中蛋丨＇１表達水平，結(jié)果表明ＨＧＳＯＣ組織中ＳＲＤ５Ａ３的蛋白表達水平顯著高于逡逑ＦＴ組織（Ｐ＜０．０００１圖１Ａ）；隨后我們通過ｑＲＴ－ＰＣＲ技術分析了邋１３例ＦＴ組織逡逑和２８例ＨＧＳＯＣ組織中ＳＲＤ５Ａ３的ｍＲＮＡ表達水平，發(fā)現(xiàn)與ＦＴ相比，ＨＧＳＯＣ組逡逑織中ＳＲＤ５Ａ３ｍＲＮＡ表達水平明顯X椉櫻ǎ校劍埃埃埃矗罰跡保攏�；晤U侵譜髁寺殉舶╁義獻櫓酒ǎ裕停粒┎⑼ü桑齲萌舊際醴治雋隋澹櫻遙模擔粒吃冢矗襖疲宰櫓停保罰崩義希齲牽櫻希米櫓校櫻遙模擔粒車鞍妝澩鎪劍櫻遙模擔粒橙舊婪直曜嘉焊菔櫓義锨釁舊咳�，将其分为４级，，阴袆蚺f海胺鄭躚糶勻舊海狽鄭械妊糶藻義先舊海卜鄭墾糶勻舊海撤鄭ㄍ跡保茫�；根据鸭g韻赴舊婊俜直齲義掀浞治錘齙燃�，０－２细胞扰f海狽鄭玻叮擔埃ハ赴舊海卜鄭擔保罰擔ハ稿義習舊海撤鄭罰叮保埃埃ハ赴舊海捶鄭喚舊慷繞婪鄭舊婊婪旨撲鬮義獻莧舊婪幀Ｆ婪紙峁允

本文編號：2610211