【摘要】：研究背景及目的卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF),也稱原發(fā)性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI),是一種高度異質性疾病,影響著0.5-3.0%的育齡期女性。未經治療的卵巢早衰患者發(fā)生骨質疏松,心血管疾病,認知能力下降和帕金森等疾病的風險成倍增加,嚴重損害女性生殖健康和生活質量~([1])。因此,卵巢早衰的防治受到越來越多學者的關注。所有形式的卵巢衰老(Premature ovarian senescence,POS)多經歷了隱匿期,生化期和終末期。早期都是無癥狀的過程,發(fā)現(xiàn)時其卵巢功能完全喪失,且?guī)缀鯚o治療方法~([2])。卵巢早衰的病因和發(fā)病機制尚不完全清楚,已知的病因包括:遺傳,感染,環(huán)境,免疫,化療,放療和手術等。9%-40%的卵巢早衰患者合并有其他自身免疫性疾病,如原發(fā)性腎上腺皮質功能不全(Addison's病)或自身免疫性甲狀腺疾病(Grave's或Hashimoto病),因此推動了對POF自身免疫病因的研究。近年來許多研究者提出自身免疫性卵巢疾病(Autoimmune ovarian disease,AOD)可能是POF發(fā)病的免疫學機制~([3-5])。前期研究證實早期過繼回輸正常小鼠的Treg(Regulatory T cells)細胞可有效預防D3tx(thymectomizeon day3)小鼠自身免疫性卵巢疾病的發(fā)生,提示Treg細胞的異常/耗竭在自身免疫性卵巢疾病發(fā)生發(fā)展中具有關鍵的作用~([6,7])。研究同時觀察到在回輸前的D3tx小鼠卵巢組織中可見大量浸潤的T細胞和B細胞,而回輸后未見,推測Treg細胞的功能紊亂與體液免疫/B細胞的后續(xù)效應性變化密切相關~([8])。這樣的調節(jié)作用是Treg細胞通過直接抑制和調節(jié)效應T細胞功能維持自身耐受性和免疫穩(wěn)態(tài)?還是Treg細胞直接抑制和調節(jié)B細胞功能?為回答這一問題,本研究檢測了自身免疫性卵巢疾病小鼠模型中Treg細胞和B細胞的時相性變化,初步探索Treg調節(jié)B細胞功能的作用機制,以期為卵巢早衰早期免疫學改變提供新線索,進而提出POF/POI治療的新方法。研究方法通過摘除新生第3天BALB/c小鼠胸腺,建立AOD小鼠動物模型(D3tx組/實驗組);定期采集外周血、卵巢、脾臟及盆腔淋巴結組織等,分別用于ELISA檢測性激素及輔助T細胞相關炎癥因子,HE染色觀察卵巢組織形態(tài)學改變;流式細胞學檢測脾臟與盆腔淋巴結中CD4~+T細胞、Treg細胞以及B細胞亞群(活化B細胞、漿細胞)的動態(tài)變化;Treg細胞(nTreg、iTreg)與B細胞體外共培養(yǎng)后,檢測B細胞增殖(CSFE)改變,并在iTreg細胞與B細胞共培養(yǎng)時,分別加入Transwell小室、TGF-β抑制劑、IL-10抑制劑,檢測B細胞增殖改變,以及iTreg細胞對B細胞凋亡(Annexin-V/FITC)的影響;為探索AOD治療窗口期,本研究還運用磁珠分選法分離正常小鼠脾臟中CD4~+CD25~+Treg(nTreg)和NaiveCD4~+T細胞,NaiveCD4~+T細胞經體外TGF-β刺激后得到iTreg細胞,分別將nTreg、iTreg經腹腔過繼回輸至術后1周和8周實驗組小鼠,并于回輸前后對卵巢組織中病理學改變進行AOD評分~([8])。研究結果1、ELISA檢測術后每周小鼠外周血中性激素(E2、FSH、LH)的濃度改變,結果顯示術后5~10周,實驗組E2均數(shù)明顯低于對照組,而FSH及LH均數(shù)明顯高于對照組。2、HE及免疫組化染色后觀察兩組小鼠卵巢組織,結果顯示:實驗組小鼠在術后第3周卵巢間質中可見少許CD19~+淋巴細胞浸潤,術后第5周卵巢間質中見大量CD3~+、CD19~+淋巴細胞浸潤,纖維組織增生,生長卵泡數(shù)目明顯減少,閉鎖卵泡數(shù)目明顯增多。術后5周AOD表現(xiàn)達到2~3級,隨時間推移,逐漸加重,到第8周時已達4級。3、ELISA檢測術后每周小鼠外周血中輔助T細胞炎癥因子表達,結果顯示:與對照組比較,實驗組術后5~10周外周血TGF-β和IL-4明顯降低,IFN-r和IL-21明顯升高。4、流式細胞學檢測分析術后1~10周、每周小鼠脾臟及盆腔淋巴結中CD4~+T細胞、Treg細胞以及B細胞亞群的動態(tài)變化,結果顯示:與對照組相比,實驗組CD4~+T細胞術后1~10周輕度升高;Treg細胞術后1~3周輕微升高,3周后逐漸下降,5~10周持續(xù)低于對照組;術后1周(CD138~-IgD~+)活化B細胞開始逐漸升高,并持續(xù)到第10周;(CD138~+CD19~-IgD~-)漿細胞在術后1~4周無明顯變化,術后5周起逐漸升高。5、采用Pearson統(tǒng)計方法分析脾臟及盆腔區(qū)域淋巴結中Treg和B細胞亞群動態(tài)變化的相關性,結果顯示:術后5~10周實驗組脾臟及盆腔區(qū)域淋巴結中Treg與漿細胞(CD138~+CD19~-IgD~-)間無相關性(r=-0.1457,P=0.05640),而Treg與活化B細胞(CD138~-IgD~+)呈負相關性(r=-0.6622,P=0.0028)。6、磁珠分選小鼠脾臟nTreg細胞、na?ve CD4~+T細胞,流式細胞學檢測細胞純度分別為96.1%、97.5%,TGF-β體外刺激na?ve CD4~+T細胞生成iTreg細胞,細胞純度為83.2%,流式細胞術分選B細胞,純度為96.8%。7、將對照組B細胞以及實驗組B+nTreg、B+iTreg細胞體外培養(yǎng)72小時后,CFSE方法檢測B細胞增殖,結果顯示:與對照組比較,實驗組兩組的B細胞增殖均顯著降低,而實驗組兩組間無統(tǒng)計學差異。8、在B細胞與iTreg細胞共培養(yǎng)體系中,(1)間接接觸培養(yǎng),加入Transwell小室,分別將B細胞加入上室,iTreg細胞加入下室;(2)直接接觸培養(yǎng),分別加入TGF-β抑制劑、IL-10抑制劑;72h后流式細胞術檢測B細胞增殖情況,結果顯示:與對照組比較,分別加入Transwell小室、TGF-β抑制劑、IL-10抑制劑三組的B細胞增殖均顯著增加。9、將對照組B細胞以及實驗組B+iTreg細胞體外培養(yǎng)16小時后,Annexin-V/FITC方法檢測B細胞凋亡,結果顯示:兩組B細胞的凋亡無統(tǒng)計學差異。10、實驗組術后1周及8周分別回輸nTreg、iTreg,比較回輸前后卵巢組織病理學變化及AOD評分,結果顯示:術后1周回輸iTreg和nTreg均可以有效預防AOD的發(fā)生,術后8周回輸iTreg和nTreg并不能有效緩解AOD的發(fā)生。結論胸腺摘除的D3tx小鼠產生了類似人類POF的典型表現(xiàn),如炎性細胞對卵巢內卵泡及間質的浸潤,包括淋巴細胞,漿細胞和單核巨噬細胞,致使卵巢結構紊亂,卵泡缺失,閉鎖。小鼠自身免疫性卵巢疾病始發(fā)于細胞免疫功能損害(T細胞數(shù)量和功能異常),后期卵巢中繼發(fā)出現(xiàn)漿細胞、活化B細胞增多,并浸潤于卵巢間質與卵泡,是研究免疫性卵巢早衰的良好模型。D3tx模型小鼠胸腺摘除后局部淋巴器官和組織中Treg細胞數(shù)量減損,經歷了代償性升高的短期保護性反應期,術后5周以后出現(xiàn)卵巢病理性改變,Treg細胞與活化B細胞呈負相關性,推測Treg細胞對B細胞的抑制作用起到了短期的保護性作用,而術后5周的Treg細胞數(shù)量減少和功能減損,導致B細胞的異�；钴S,與后續(xù)的卵巢局部組織損害的發(fā)生密切相關。在后續(xù)的體外共培養(yǎng)體系中,驗證了Treg細胞是通過細胞接觸和分泌細胞因子途徑來抑制B細胞增殖的。卵巢組織病理損害發(fā)生前,過繼回輸nTreg及iTreg細胞均能有效抑制AOD的發(fā)生,而在病理損害發(fā)生以后過繼回輸兩組Treg細胞,均不能有效改善AOD結局。提示臨床免疫性POF的治療也應存在一定的窗口期,早期診斷非常重要。
【圖文】：

圖1 兩組小鼠血清性激素E2、FSH及LH的比較（*P<0.05，** P<0.01）2.3.2 卵巢組織形態(tài)學卵巢組織病理學及免疫組化染色觀察小鼠卵巢組織病理學改變（見圖2）。與對照組相比(圖2A),實驗組小鼠術后第5周卵巢體積明顯變小,皮質中見到大量纖維組織增生,生長卵泡數(shù)目明顯減少,閉鎖卵泡數(shù)目明顯增多(圖2B);對照組卵泡及卵巢間質中可見少量CD3+(圖2C)、CD19+淋巴細胞(圖2E)；實驗組卵泡及卵巢間質中可見明顯CD3+(圖2D)、CD19+淋巴細胞(圖2F)。圖2 兩組小鼠術后第5周卵巢組織病理學及免疫組織化學分析（其中A/C/E是對照組，B/D/F為實驗組，A/Bx40倍，C/D/E/Fx200倍）

陸軍軍醫(yī)大學碩士學位論文20圖1 兩組小鼠血清性激素E2、FSH及LH的比較（*P<0.05，** P<0.01）2.3.2 卵巢組織形態(tài)學卵巢組織病理學及免疫組化染色觀察小鼠卵巢組織病理學改變（見圖2）。與對照組相比(圖2A),實驗組小鼠術后第5周卵巢體積明顯變小,皮質中見到大量纖維組織增生,生長卵泡數(shù)目明顯減少,閉鎖卵泡數(shù)目明顯增多(圖2B);對照組卵泡及卵巢間質中可見少量CD3+(圖2C)、CD19+淋巴細胞(圖2E)；實驗組卵泡及卵巢間質中可見明顯CD3+(圖2D)、CD19+淋巴細胞(圖2F)。圖2 兩組小鼠術后第5周卵巢組織病理學及免疫組織化學分析（其中A/C/E是對照組，，B/D/F為實驗組，A/Bx40倍，C/D/E/Fx200倍）
【學位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R711.75

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本文編號：2607149