【摘要】：順鉑是治療包括卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的一線藥物,但多數(shù)晚期卵巢癌患者會(huì)對(duì)鉑類藥物產(chǎn)生抗性。因此,如何增加順鉑的敏感性是人們關(guān)注的問(wèn)題。自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)重要的降解途徑,通過(guò)形成自噬溶酶體降解損傷的蛋白以及細(xì)胞器。這一完整的過(guò)程也稱為自噬流量(autophagic flux)。盡管細(xì)胞自噬是一把雙刃劍,但目前研究證實(shí)腫瘤細(xì)胞的自噬能夠拮抗化療藥物的作用,自噬水平的增加可能與腫瘤對(duì)化療藥物敏感性下降有關(guān)。然而在臨床上很難評(píng)價(jià)卵巢癌患者腫瘤組織中自噬水平的高低,這給靶向細(xì)胞自噬治療腫瘤帶來(lái)了困難。p62是自噬的受體蛋白之一。以往的研究證實(shí)p62在包括卵巢癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)組的前期工作發(fā)現(xiàn)卵巢癌順鉑耐藥SKOV3/DDP細(xì)胞原發(fā)性高表達(dá)p62,且自噬水平較高;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),原發(fā)性高表達(dá)的p62通過(guò)ZZ結(jié)構(gòu)域活化了促存活的NF-κB信號(hào)通路,降低了卵巢癌細(xì)胞的順鉑敏感性。然而,當(dāng)給予卵巢癌細(xì)胞自噬抑制劑氯喹或巴弗羅霉素時(shí),細(xì)胞的順鉑敏感性明顯增加,而此時(shí)p62的表達(dá)量也顯著增高(誘導(dǎo)性p62)。這些結(jié)果提示,當(dāng)細(xì)胞處于高水平的自噬時(shí),p62發(fā)揮促存活作用;反之,當(dāng)自噬流量受阻,p62可能發(fā)揮促死亡作用。表明不能僅僅依靠表達(dá)量來(lái)判斷p62在卵巢癌中的作用,細(xì)胞的自噬水平(自噬流量)可能是決定p62發(fā)揮促存活還是促死亡作用的關(guān)鍵。因此需要進(jìn)一步探究p62與自噬之間的調(diào)控關(guān)系。p62具有豐富的蛋白結(jié)合序列,包含了UBA(泛素化蛋白結(jié)構(gòu)域),LIR(自噬體膜LC3結(jié)合序列),ZZ(鋅指結(jié)構(gòu)域)等功能性結(jié)構(gòu)域。因此,p62作為一個(gè)“信號(hào)樞紐”,通過(guò)與不同蛋白的交互作用決定了其參與細(xì)胞存活信號(hào)還是凋亡信號(hào)。Caspase 8是經(jīng)典的外源凋亡信號(hào)啟動(dòng)子。目前研究證實(shí),Caspase 8在惡性度高的卵巢癌細(xì)胞中低表達(dá);抑制卵巢癌細(xì)胞中Caspase 8的表達(dá)能夠降低細(xì)胞對(duì)化療藥物的凋亡敏感性。除了蛋白酶體系統(tǒng)以外,自噬也參與了Caspase 8的活化和降解。提示通過(guò)探討p62在Caspase 8介導(dǎo)的凋亡通路中的作用,可能有助于闡明抑制自噬增加順鉑等化療藥物敏感性的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)從p62的功能性結(jié)構(gòu)域入手結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),通過(guò)探討自噬抑制導(dǎo)致的p62累積在順鉑誘導(dǎo)的Caspase 8活化中的作用,闡明自噬與凋亡的調(diào)控機(jī)制,為靶向自噬治療卵巢癌提供依據(jù)。方法:一、構(gòu)建A2780荷瘤小鼠模型,設(shè)置空白對(duì)照組(給予PBS),順鉑單獨(dú)給藥組(給予3mg/kg順鉑),自噬抑制劑氯喹單獨(dú)給藥組(給予35mg/kg氯喹)以及順鉑和氯喹聯(lián)合治療組。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組p62蛋白的表達(dá)、試劑盒法檢測(cè)Caspase 8的酶活性、TUNEL染色檢測(cè)凋亡率。二、構(gòu)建野生型p62以及UBA和LIR結(jié)構(gòu)域突變的p62質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3細(xì)胞,開展以下實(shí)驗(yàn):1.SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型p62以及p62蛋白UBA結(jié)構(gòu)域突變體,MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性差異。2.選用6μg/ml順鉑作用細(xì)胞24h,通過(guò)AnnexinV/PI染色流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst染色、Caspase 3/7酶活性檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。3.6μg/ml順鉑作用細(xì)胞12h,通過(guò)酶活性試劑盒以及Western Blot法檢測(cè)Caspase 8的活化情況。4.評(píng)價(jià)各組細(xì)胞在順鉑刺激下自噬水平的差異。分別導(dǎo)入野生型p62以及UBA、LIR結(jié)構(gòu)域突變的p62蛋白,6μg/ml順鉑作用細(xì)胞12h,利用1%Triton-SDS分離細(xì)胞總蛋白,檢測(cè)不可溶(Insoluble)泛素化蛋白的表達(dá);通過(guò)mCherry-GFP-LC3串聯(lián)病毒構(gòu)建SKOV3細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,檢測(cè)各組細(xì)胞的自噬流量;利用DQ-BSA法評(píng)價(jià)通過(guò)自噬-溶酶體途徑降解的蛋白量。5.SKOV3細(xì)胞分別導(dǎo)入野生型p62以及UBA、LIR結(jié)構(gòu)域突變的p62蛋白,順鉑作用12h后,通過(guò)免疫共沉淀法以及免疫熒光法檢測(cè)p62、LC3與Caspase 8的結(jié)合情況。構(gòu)建并純化野生型p62、UBA以及LIR突變體的GST融合蛋白,在卵巢癌荷瘤小鼠腫瘤組織中檢測(cè)p62與Caspase 8、LC3的結(jié)合。三、通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)160例卵巢癌患者腫瘤組織中p62與Caspase8的表達(dá),統(tǒng)計(jì)蛋白表達(dá)量與生存期,TNM分期、復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)等臨床特征的相關(guān)性。結(jié)果:1.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),與順鉑單獨(dú)治療組相比,自噬抑制劑氯喹與順鉑聯(lián)合治療促進(jìn)了p62在腫瘤組織中的表達(dá);同時(shí),順鉑與氯喹聯(lián)合治療組Caspase 8的酶活性顯著增強(qiáng);TUNEL染色陽(yáng)性率增加。2.MTT結(jié)果表明,與過(guò)表達(dá)野生型p62相比,導(dǎo)入p62蛋白UBA結(jié)構(gòu)域突變體后SKOV3細(xì)胞的順鉑敏感性降低。3.凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與過(guò)表達(dá)野生型p62相比,導(dǎo)入p62蛋白UBA結(jié)構(gòu)域突變體后,在相同劑量的順鉑刺激下,SKOV3細(xì)胞Annexin V/PI染色陽(yáng)性率降低;染色質(zhì)濃染,細(xì)胞核碎裂等具有凋亡特征的細(xì)胞數(shù)量減少;Caspase 3/7的酶活性降低。同時(shí)Caspase 8的切割以及酶活性受到抑制。4.評(píng)價(jià)各組細(xì)胞自噬水平發(fā)現(xiàn),導(dǎo)入p62蛋白UBA和LIR突變體后,細(xì)胞內(nèi)非可溶形式(Insoluble)的泛素化蛋白聚集體減少;細(xì)胞中代表晚期自噬溶酶體的紅色熒光增加,同時(shí)代表未成熟的自噬體的綠色熒光降低;同時(shí),SKOV3細(xì)胞導(dǎo)入p62兩種突變體后,DQ-BSA的熒光強(qiáng)度增加。以上結(jié)果表明,p62蛋白的UBA和LIR結(jié)構(gòu)域突變?cè)黾恿思?xì)胞的自噬流量。5.免疫熒光和免疫共沉淀結(jié)果表明,與過(guò)表達(dá)野生型p62相比,UBA和LIR結(jié)構(gòu)域突變體顯著抑制了Caspase 8與LC3的結(jié)合;GST-pull down實(shí)驗(yàn)表明,p62蛋白UBA以及LIR結(jié)構(gòu)域突變體顯著抑制了p62與Caspase8以及LC3的結(jié)合。6.斯皮爾曼相關(guān)性分析結(jié)果顯示,在160例卵巢癌患者中,p62與Caspase8的表達(dá)存在相關(guān)性(pho=0.499,P0.01);聯(lián)合分析p62和Caspase8的表達(dá)發(fā)現(xiàn),53例患者同時(shí)高表達(dá)p62和Caspase 8,且與p62單獨(dú)高表達(dá)相比,p62/Caspase8共同高表達(dá)患者的生存時(shí)間更長(zhǎng)(P=0.22),腫瘤惡性程度和復(fù)發(fā)率更低。結(jié)論:1、體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)共同證實(shí)自噬抑制促進(jìn)了順鉑對(duì)Caspase 8的活化作用,而激活的Caspase 8可能與抑制自噬增加卵巢癌細(xì)胞的順鉑敏感性有關(guān)。2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染p62蛋白UBA和LIR結(jié)構(gòu)域點(diǎn)突變體,抑制了順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞Caspas8的活化,增加了細(xì)胞自噬流量,提示自噬流量可能會(huì)影響p62對(duì)Caspase 8的活化作用,其作用機(jī)制與UBA和LIR結(jié)構(gòu)域有關(guān)。3、通過(guò)免疫共沉淀、免疫熒光以及GST-pull Down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在卵巢癌細(xì)胞中p62、Caspase 8以及LC3存在共定位。提示自噬體膜可能為p62活化Caspase8提供了“分子平臺(tái)”,可見自噬流量是決定p62是否活化Caspase 8的主要因素。與原發(fā)性高表達(dá)的p62不同,抑制自噬導(dǎo)致的p62累積(誘導(dǎo)性)可能通過(guò)增加順鉑對(duì)Caspase 8的活化發(fā)揮了促死亡作用,增加了卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。4、組織芯片結(jié)果顯示,與p62單獨(dú)高表達(dá)組相比,Caspase 8與p62共同高表達(dá)的卵巢癌患者生存期較長(zhǎng)、惡性程度與復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低,由此推測(cè)Caspase 8可能作為p62的輔助分子,增加對(duì)卵巢癌患者預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)Caspase 8不僅僅能夠介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào),通過(guò)與p62聯(lián)合分析,Caspase 8還可能間接反映卵巢癌細(xì)胞的自噬水平,這些機(jī)制的探討可能有助于闡明抑制自噬增加順鉑等化療藥物敏感性的機(jī)制,為卵巢癌臨床患者預(yù)后以及對(duì)化療藥物敏感性的判定提供新的線索。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2606027