【摘要】：卵巢癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的高度惡性腫瘤,其早期無典型臨床癥狀及體征,一旦出現(xiàn)癥狀多屬晚期,病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首。雖然腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以,鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療使其患者5年生存率有所改善,但卵巢癌臨床診治并無實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。這主要由于缺乏臨床實(shí)用的早期診斷手段和療效持久的治療方案,其根本原因在于對卵巢癌的早期診斷、發(fā)生發(fā)展、預(yù)后等的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)不清,因此預(yù)測卵巢癌的預(yù)后,尋找卵巢癌早期篩查的手段和卵巢癌新的治療靶點(diǎn)仍舊是卵巢癌研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。上皮性卵巢癌是卵巢腫瘤的主要類型,它有四種主要的組織學(xué)亞型:漿液型、子宮內(nèi)膜樣、粘液型和透明細(xì)胞型;其中高級漿液性卵巢癌(HGSOC)約占全部卵巢癌的70%左右,易發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移,預(yù)后極差,是上皮性卵巢癌中最常見也是惡性程度最高的亞型。本研究主要對漿液性卵巢癌進(jìn)行研究,后文均以卵巢癌稱之。Notch3是參與調(diào)控細(xì)胞發(fā)育和分化的Notch家族的重要成員之一。既往研究表明,Notch3的失調(diào)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),包括肺癌,乳腺癌,卵巢癌等。2011年TCGA對卵巢癌進(jìn)行的基因組和表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)Notch3在卵巢癌中存在基因擴(kuò)增和調(diào)控異常,并且有研究證實(shí)在66%卵巢癌中存在Notch3基因擴(kuò)增及過度表達(dá),其異常表達(dá)與卵巢癌的不良預(yù)后密切相關(guān)。然而,參與Notch3通路的潛在分子靶點(diǎn)尚未被完全理解。SUSD2是單通道1型膜蛋白,常表達(dá)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,血管周圍平滑肌細(xì)胞,以及許多腫瘤細(xì)胞系。之前的研究表明,在許多腫瘤中(例如,肝癌,肺癌等),SUSD2表達(dá)水平低于正常組織,過表達(dá)SUSD2后可抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖。但在乳腺癌中,SUSD2的表達(dá)相比于乳腺良性腫瘤增加,并且過表達(dá)SUSD2后可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡;在胃癌中SUSD2也參與了腫瘤細(xì)胞的惡性行為過程。由此可見,在不同類型的腫瘤組織中,SUSD2的表達(dá)與腫瘤發(fā)生及進(jìn)展的相關(guān)性是存在較大差異的。并且有研究發(fā)現(xiàn)SUSD2可作為Notch3的潛在下游基因,基于Notch3與卵巢癌不良預(yù)后的關(guān)系,提示SUSD2在卵巢癌的發(fā)展過程中存在一定的作用。因此本課題組推測SUSD2或許也與卵巢癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān)聯(lián),影響卵巢癌預(yù)后,這將為卵巢癌的治療提供新的思路。細(xì)胞周期蛋白G1(CCNG1)是一種細(xì)胞周期蛋白G家族蛋白,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長。盡管CCNG1的功能尚不十分明確,但有已不少研究表明CCNG1在許多類型的惡性腫瘤中存在異常表達(dá),如EOC、肝細(xì)胞癌和肺癌,并且參與了腫瘤細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移等過程。有研究顯示,在肝癌中,Notch3能夠調(diào)節(jié)CCNG1的表達(dá),因此本課題組猜想在卵巢癌中,CCNG1與Notch3之間或許存在一定的關(guān)聯(lián),并參與了卵巢癌的惡性行為過程。本課題也基于此對CCNG1在卵巢癌發(fā)展過程中的作用進(jìn)行探討。本課題主要明確SUSD2、CCNG1與Notch3在卵巢癌中的關(guān)系,探討它們在卵巢癌中的表達(dá)情況、發(fā)生發(fā)展中的作用并研究其具體的作用機(jī)制,為卵巢癌的診治提供新的思路。研究內(nèi)容分為以下三部分:一、SUSD2、CCNG1在卵巢癌中的表達(dá)情況及其臨床意義。二、SUSD2促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移,化療耐藥及其相關(guān)的分子機(jī)制研究。三、CCNG1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機(jī)制研究。第一部分:SUSD2、CCNG1在卵巢癌中的表達(dá)情況及其臨床意義研究目的:卵巢癌,尤其是漿液性卵巢癌,作為危害女性健康的婦產(chǎn)惡性腫瘤,其病死率高,預(yù)后差。重要的原因在于臨床上缺乏早期有效的分子標(biāo)記物及治療靶點(diǎn)。Notch3被證實(shí)在卵巢癌中對腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥性的產(chǎn)生至關(guān)重要,因此通過對Notch3的下游調(diào)節(jié)基因的研究,尋找有效的分子靶點(diǎn)將有望改善卵巢癌的預(yù)后。SUSD2是一種含有822個(gè)氨基酸Ⅰ型膜蛋白,參與了許多腫瘤發(fā)生發(fā)展過程,但其在卵巢癌中的作用機(jī)制尚未明確。CCNG1是細(xì)胞周期蛋白,能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖,但其對卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及化療耐藥作用并不清楚。本研究通過明確SUSD2、CCNG1與Notch3的關(guān)系,研究SUSD2、CCNG1在卵巢癌中的表達(dá)情況,并將它們的表達(dá)情況與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析,進(jìn)而發(fā)現(xiàn)SUSD2、CCNG1在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中所起的作用。材料和方法:構(gòu)建卵巢癌Notch3過表達(dá)及干擾細(xì)胞系,利用Westen-blot(WB),RT-qPCR等檢測Notch3對SUSD2及CCNG1的調(diào)節(jié)作用。收集卵巢癌標(biāo)本,并以正常FTE組織進(jìn)行對照,利用免疫組化,WB,RT-qPCR等檢測二者之中SUSD2、CCNG1表達(dá)量的差異。根據(jù)免疫組化染色情況,將患者劃分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,匯總卵巢癌患者的臨床信息,分析SUSD2、CCNG1表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:在卵巢癌細(xì)胞系中過表達(dá)Notch3能夠上調(diào)SUSD2、CCNG1的表達(dá);干擾Notch3后,SUSD2、CCNG1的表達(dá)均降低。SUSD2、CCNG1在卵巢癌中表達(dá)明顯高于正常對照:免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)SUSD2、CCNG1在卵巢癌中的表達(dá)明顯高于輸卵管傘中的表達(dá);RT-qPCR及Westen-blot(WB)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CCNG1在卵巢癌中存在高表達(dá)。生存分析顯示:SUSD2及CCNG1高表達(dá)組相比SUSD2及CCNG1低表達(dá)組預(yù)后均明顯較差,SUSD2高表達(dá)組卵巢癌患者的2年存活率及2年無進(jìn)展生存率時(shí)間均低于SUSD2低表達(dá)組患者,并且SUSD2高表達(dá)與卵巢癌的大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移率,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率和化療耐藥呈正相關(guān)。通過聯(lián)合SUSD2和CCNG1的表達(dá)情況與卵巢癌預(yù)后進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),SUSD2和CCNG1同時(shí)高表達(dá)的卵巢癌患者組的總生存期(OS)和無進(jìn)展生存期(PFS)明顯短于SUSD2和CCNG1同時(shí)低表達(dá)的卵巢癌患者組。結(jié)論:在卵巢癌中Notch3能夠調(diào)節(jié)SUSD2和CCNG1的表達(dá)。SUSD2和CCNG1在卵巢癌中存在高表達(dá),且高表達(dá)的SUSD2、CCNG1與卵巢癌的不良預(yù)后相關(guān),聯(lián)合檢測分析SUSD2和CCNG1的表達(dá)能更好地預(yù)測卵巢癌的預(yù)后情況。第二部分:SUSD2促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移,化療耐藥及其相關(guān)的分子機(jī)制研究研究目的:卵巢癌具有致死率高,預(yù)后差的特點(diǎn),其腫瘤細(xì)胞的侵襲能力強(qiáng),易發(fā)生早期及廣泛的盆腔和大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致手術(shù)無法完全切除腫瘤。第一部分結(jié)果中表明SUSD2高表達(dá)與卵巢癌的腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),提示SUSD2參與卵巢癌的轉(zhuǎn)移過程。并且,化療耐藥后復(fù)發(fā)也是引起卵巢癌不良預(yù)后的一個(gè)重要因素。目前尚不明確SUSD2在卵巢癌化療耐藥中是否發(fā)揮作用。第一部分結(jié)果中SUSD2的高表達(dá)與卵巢癌鉑耐藥相關(guān),提示SUSD2參與卵巢癌細(xì)胞的鉑耐藥過程。本研究目的是通過調(diào)控卵巢癌細(xì)胞系中SUSD2的表達(dá)水平來檢測SUSD2對轉(zhuǎn)移能力及化療耐藥過程的影響,為卵巢癌的治療提供新的思路。材料和方法:選取合適的卵巢癌細(xì)胞系(SKOV3,CAOV3,HO8910),構(gòu)建SUSD2過表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒,利用慢病毒包裝感染體系感染卵巢癌細(xì)胞系,使其低表達(dá)或過表達(dá)SUSD2基因,篩選出穩(wěn)定的細(xì)胞系。利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測SUSD2對卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響;利用Westen-blot方法對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測,建立SUSD2改變與EMT的關(guān)聯(lián);WB方法檢測細(xì)胞表面粘連蛋白EpCAM的改變情況,用Rescue實(shí)驗(yàn)檢測EpCAM的改變對SUSD2與細(xì)胞發(fā)生EMT之間的作用;并且利用裸鼠尾靜脈注射癌細(xì)胞驗(yàn)證SUSD2對卵巢癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的影響。對卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行一定濃度的順鉑藥物刺激,利用WB檢測卵巢癌細(xì)胞SUSD2表達(dá)水平是否隨順鉑作用時(shí)間的變化而發(fā)生改變;利用MTT法檢測干擾SUSD2或過表達(dá)SUSD2對卵巢癌細(xì)胞順鉑化療敏感性的影響;利用WB及qRT-PCR檢測SUSD2過表達(dá)或低表達(dá)后自噬相關(guān)分子的變化情況,以明確SUSD2對自噬的影響;GFP-RPF-LC3腺病毒感染SKOV3細(xì)胞后,熒光顯微鏡下觀察SUSD2改變對自噬的影響:利用氯喹來抑制細(xì)胞自噬后檢測過表達(dá)SUSD2細(xì)胞系對順鉑敏感性的影響。結(jié)果:通過Transwell實(shí)驗(yàn)表明:SUSD2過表達(dá)后,卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移能力明顯增強(qiáng),干擾SUSD2后細(xì)胞侵襲遷移能力明顯減弱。WB檢測顯示SUSD2可以調(diào)控卵巢癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,主要表現(xiàn)為過表達(dá)SUSD2后上皮性標(biāo)志物E-cadherin(E-CAD)下調(diào),N-cadherin(N-CAD)上調(diào),EMT轉(zhuǎn)錄因子SLUG上調(diào);而SUSD2敲低后表達(dá)則相反;干擾SUSD2后,EpCAM表達(dá)降低;過表達(dá)SUSD2則可上調(diào)卵巢癌細(xì)胞EpCAM的表達(dá);Rescue實(shí)驗(yàn)證實(shí)了下調(diào)EpCAM后可以降低SUSD2過表達(dá)引起的E-CAD下調(diào)水平,并且削弱SUSD2過表達(dá)引起的卵巢癌細(xì)胞增強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力;通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾SUSD2可以抑制卵巢癌細(xì)胞在裸鼠中的肺轉(zhuǎn)移能力。卵巢癌細(xì)胞施加順鉑刺激后,WB顯示隨著順鉑作用時(shí)間延長,細(xì)胞SUSD2表達(dá)增加。加藥MTT顯示,過表示SUSD2后卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性降低,其半數(shù)致死量(IC50)顯著高于正常對照組;敲低SUSD2的表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性增強(qiáng),IC50明顯低于正常對照組。通過檢測自噬相關(guān)分子發(fā)現(xiàn):過表達(dá)SUSD2誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生自噬,而降低SUSD2表達(dá)則抑制卵巢癌細(xì)胞自噬水平。熒光顯微鏡下觀察到SUSD2過表達(dá)后,自噬小體增多。氯喹抑制細(xì)胞自噬后,過表達(dá)SUSD2的卵巢癌細(xì)胞增強(qiáng)的耐藥性被削弱。結(jié)論:在卵巢癌中SUSD2的過表達(dá)可以通過EpCAM的上調(diào)來調(diào)節(jié)EMT相關(guān)分子的變化,從而誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT,最終增強(qiáng)卵巢癌的轉(zhuǎn)移能力;并且SUSD2可以通過誘導(dǎo)自噬,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞鉑化療耐藥。第三部分:CCNG1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及其機(jī)制研究研究目的:卵巢癌病死率高,其5年存活率不到50%,這不僅僅是由于卵巢癌細(xì)胞侵襲能力強(qiáng),易轉(zhuǎn)移,還因?yàn)槠鋵λ幬锏脑l(fā)性或繼發(fā)性耐藥,病情緩解后易復(fù)發(fā)。Notch3在卵巢癌的轉(zhuǎn)移和耐藥過程中扮演著重要的角色,第一部分結(jié)果中提示Notch3能夠調(diào)節(jié)CCNG1的表達(dá)。目前尚不明確CCNG1在卵巢癌轉(zhuǎn)移和化療耐藥過程中的作用及機(jī)制。CCNG1的高表達(dá)與卵巢癌不良預(yù)后相關(guān),提示CCNG1可能參與卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和順鉑耐藥過程。本研究主要探討CCNG1對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力及化療耐藥的影響。材料與方法:選取合適的卵巢癌細(xì)胞系(A2780,H08910),構(gòu)建CCNG1過表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒,利用慢病毒包裝感染體系感染卵巢癌細(xì)胞系,改變細(xì)胞的CCNG1表達(dá)水平;過表達(dá)及干擾效率被驗(yàn)證后,通過Transwell檢測卵巢癌細(xì)胞系CCNG1過表達(dá)或干擾后對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;利用WB檢測卵巢癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化;并且利用裸鼠尾靜脈注射癌細(xì)胞驗(yàn)證CCNG1對卵巢癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的影響;對卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行一定濃度的順鉑藥物刺激,利用WB檢測卵巢癌細(xì)胞CCNG1表達(dá)水平是否隨順鉑作用時(shí)間的變化而發(fā)生改變;利用MTT法檢測干擾CCNG1或過表達(dá)CCNG1對卵巢癌細(xì)胞順鉑化療敏感性的影響。結(jié)果:Transwell結(jié)果顯示CCNG1過表達(dá)后,卵巢癌細(xì)胞侵襲遷移能力明顯增強(qiáng),干擾CCNG1后細(xì)胞侵襲遷移能力明顯減弱,且細(xì)胞中EMT標(biāo)志分子(N-CAD,SLUG,SNAIL)相應(yīng)發(fā)生變化:過表達(dá)CCNG1后上皮性標(biāo)志物N-CAD上調(diào),EMT轉(zhuǎn)錄因子SLUG和SNAIL上調(diào),而CCNG1敲低后表達(dá)則相反;通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾CCNG1可以抑制卵巢癌細(xì)胞在裸鼠中的肺轉(zhuǎn)移能力;A2780.H08910細(xì)胞施加順鉑刺激后,WB結(jié)果顯示隨著順鉑作用時(shí)間延長,細(xì)胞中的CCNG1表達(dá)增加;加藥MTT顯示,敲低CCNG1的表達(dá)后卵巢癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性減弱,IC50明顯低于正常對照組。結(jié)論:卵巢癌中CCNG1可增強(qiáng)卵巢癌的轉(zhuǎn)移能力,CCNG1促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移能力是通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT實(shí)現(xiàn)的;并且CCNG1可以促進(jìn)卵巢癌順鉑耐藥。
【圖文】：

卵巢癌細(xì)胞中Ｎｏｔｃｈ３對ＳＵＳＤ２及ＣＣＮＧｌ的調(diào)節(jié)作用。逡逑（Ａ）干擾Ｎｏｔｃｈ３后，卵巢癌細(xì)胞中ＳＵＳＤ２和ＣＣＮＧｌ的ｍＲＮＡ表達(dá)下降；逡逑（Ｂ）干擾Ｎｏｔｃｈ３后，卵巢癌細(xì)胞中ＳＵＳＤ２和ＣＣＮＧｌ的蛋白表達(dá)下降；逡逑（Ｃ）過表達(dá)ＮＩＣＤ３邋（Ｎｏｔｃｈ３的活性部分）上調(diào)卵巢癌細(xì)胞中ＳＵＳＤ２ＣＣＮＧｌ的ｍＲＮＡ邋７Ｋ平；（Ｄ）過表達(dá)ＮＩＣＤ３后，卵巢癌細(xì)胞中ＳＵＳＤ２ＣＣＮＧｌ的蛋白表達(dá)升高。逡逑

邋ＳＵＳＤ２在ＨＧＳＯＣ中相比輸卵管傘組織存在氋表達(dá)。逡逑）邋ＳＵＳＤ２在ＨＧＳＯＣ組織及ＦＴＥ組織中的表達(dá)情況ＩＨＣ示意圖；（Ｂ）邋ＩＨＣ逡逑結(jié)果顯示，，ＳＵＳＤ２在ＨＧＳＯＣ組織中的表達(dá)明顯高于ＦＴＥ組織。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑＜邋１Ｓ１邐ｐ＝０．０１５６邐——ＥＩＥ邐ＨＳＳＱ＾＿逡逑２邋ｃ邐邋邋ＦＩ邐Ｆ２邋Ｆ３邋Ｆ４邋Ｔ１邋Ｔ２邋Ｔ３邋Ｔ４逡逑｜邋Ｚ邐ＣＣＮＧ１１邐＞邋一普逡逑５邋ａ．１０－邐■■邐Ｐ－ａｃｔｉｎ邋｜邐—丨邋＿邐—一一｜逡逑Ｉｆ邋？？：命逡逑５邋ｉ邋°－５－邐ＦＴＥ邐ＨＧＳＯＣ逡逑１邋ｇ．邋—＾—邋■■ＪＪｌｆ＂邐Ｆ５邋Ｆ６邋Ｆ７邋Ｔ５邋Ｔ６邋Ｔ７邋Ｔ８邋Ｔ４逡逑Ｉ２邋上邋＂哥榞邐ＣＣＮＧｌｌ邐

本文編號：2602667