【摘要】：背景和目的先天性腎積水(congential hydronephrosis,CHN)是產(chǎn)前超聲檢查最常見的發(fā)育畸形之一,其發(fā)生率為新生兒的1-5%。CHN的臨床病因很多,從子宮內(nèi)短暫的生理性腎積水到臨床上顯著的腎臟和泌尿道先天性發(fā)育異常,但臨床上最常見的病理性腎積水病因是腎盂輸尿管連接處梗阻(pelvic-ureteric junction obstruction,PUJO),發(fā)病率為0.1%,占重度腎積水病例的50%,也是引起嬰幼兒和兒童終末期腎功能衰竭的常見原因。由于CHN的病理生理機制及其轉(zhuǎn)歸仍不完全清楚,人們對先天性PUJO導(dǎo)致的腎積水患兒的治療和后續(xù)管理還存在爭議。由于CHN發(fā)生于胚胎時期,目前人們最早只能通過影像學(xué)檢查對發(fā)育過程中胎兒腎臟的形態(tài)及血流動力學(xué)方面進行監(jiān)測,但實際上腎臟的大體功能以及細(xì)胞和分子改變遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于形態(tài)學(xué)變化,而CHN的轉(zhuǎn)歸及治療方案的選擇很大程度取決于胎兒時期的腎功能的情況。因此對于人胚胎時期腎臟發(fā)育過程中病理生理變化規(guī)律的探索有助于圍產(chǎn)期及兒科醫(yī)師對CHN患兒制定出更加合理的治療方案。然而由于臨床收集胎兒腎臟標(biāo)本難度較大使相關(guān)研究很難進行,目前,人胚胎時期腎臟發(fā)育過程中包括正常及病理狀態(tài)下功能相關(guān)的研究幾乎空白,因此如何對腎積水胎兒腎臟功能變化進行預(yù)測或檢查是臨床急需解決的課題。尿液濃縮與水重吸收功能障礙是腎積水腎臟早期的功能變化,文獻報道水通道蛋白1-3(aquaporin1-3,AQP1-3)表達下調(diào)與上述變化有關(guān)。AQP1是最早發(fā)現(xiàn)的水通道蛋白,主要位于腎臟近端小管和髓袢降支細(xì)段的頂質(zhì)膜和基底膜上,其在近端腎單位重吸收水分和尿液濃縮中起重要作用;AQP2主要位于腎臟集合管主細(xì)胞的頂質(zhì)膜和胞漿內(nèi)囊泡中,是集合管水分重吸收的重要物質(zhì);AQP3位于集合管主細(xì)胞基底側(cè)膜上,對于水分的重吸收和產(chǎn)生濃縮尿液也有一定的作用。前期對兒童腎積水腎臟的研究顯示,腎積水時腎臟AQP1-3表達均下調(diào),并且AQP1-3的表達下調(diào)是腎臟水分重吸收和尿液濃縮功能受損的主要原因。長時間大量稀釋尿液的產(chǎn)生容易發(fā)生電解質(zhì)平衡紊亂,因此腎臟AQP1-3的正常表達對機體水代謝平衡的維持非常重要。動物胎兒期腎臟水通道蛋白AQP1-3表達的研究已有文獻報道,隨著胎兒腎臟的發(fā)育,AQP1-3的表達越來越明顯。但是,由于胎兒時期在宮內(nèi)發(fā)育的特殊性,在臨床上不能直接檢測胎兒腎臟中AQPs的表達,因此前期關(guān)于人胎兒腎臟中AQPs表達規(guī)律的研究幾乎沒有報道。人體AQP2與其它亞型的水通道蛋白不同,其主要位于腎臟集合管上皮細(xì)胞,在腎臟組織中特異性表達。前期研究發(fā)現(xiàn)大約3%的腎臟AQP2可以隨脫落的集合管上皮細(xì)胞進入尿液排出體外,并且隨尿液排出的AQP2的比例不受人體生理狀態(tài)的影響,這提示尿液中的AQP2可以反映腎臟AQP2的表達水平。另有研究發(fā)現(xiàn)CHN兒童尿液中AQP2的水平與腎積水的嚴(yán)重程度及腎臟濃縮尿液的功能有顯著相關(guān)性,這說明患者尿液中的AQP2可以間接反映腎臟積水的嚴(yán)重程度及尿液濃縮功能。到妊娠中后期,胎兒尿液是羊水的主要來源,AQP2具有腎臟組織特異性,故羊水中的AQP2蛋白只能來源于胎兒腎臟,檢測羊水的AQP2能反映出腎積水的嚴(yán)重程度及腎臟濃縮尿液功能。但是目前有關(guān)胎兒羊水中AQP2含量與胎兒腎臟中AQP2的表達情況的關(guān)系尚未見報道。羊水穿刺目前在臨床上是一項成熟的有創(chuàng)檢查,隨著計劃生育二胎政策的實施,越來越多的高齡產(chǎn)婦接受了行羊膜腔穿刺進行產(chǎn)前篩查,這為通過羊水檢測AQP2提供了可能。因此本研究的第一和第二部分首先探討了人發(fā)育過程中正常及腎積水胎兒腎臟AQP1-3的表達規(guī)律及羊水中的AQP2與胎兒腎臟中的AQP2蛋白表達之間的關(guān)系,為臨床上早期對腎積水胎兒腎臟功能變化進行預(yù)測或檢查提供參考。臨床上對于CHN患者的治療和管理方案的選擇仍存在爭議,多數(shù)臨床指南建議如下:對于輕度CHN患者行保守觀察治療,PUJO導(dǎo)致的中重度CHN患者往往需要外科手術(shù)解除梗阻。但是前期較多的研究發(fā)現(xiàn)對于腎積水腎臟即使早期手術(shù)解除梗阻,腎臟濃縮尿液的功能仍不能完全恢復(fù),并且仍會有持續(xù)的大量稀釋尿液產(chǎn)生,這主要與梗阻解除后腎臟AQP2蛋白表達未能恢復(fù)正常有關(guān)。因此前期很多學(xué)者針對梗阻及梗阻解除后患者腎臟濃縮功能的治療進行了較多的探索,但是目前仍未找到理想的預(yù)防CHN嬰幼兒患者AQP2下調(diào)的方法。他丁類及沙坦類藥物能夠防止梗阻造成的AQP2下調(diào),促進梗阻解除后AQP2蛋白表達及腎臟尿液濃縮功能的恢復(fù),但此類藥物可能會加重梗阻造成的嬰幼兒腎臟損傷,限制了其臨床應(yīng)用。近年來,促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)對受損腎臟功能的保護作用的報道引起了大家的關(guān)注。任川等也發(fā)現(xiàn)EPO能促進幼鼠輸尿管梗阻解除后AQP2蛋白及腎臟功能的恢復(fù)。但是EPO調(diào)節(jié)AQP2的具體機制,以及其是否可以促進梗阻解除后AQP1和AQP3蛋白的表達以及腎臟水分重吸收功能的恢復(fù)尚未見文獻報道。目前,EPO已經(jīng)在臨床上用于治療新生兒缺血缺氧性腦病,EPO是否可以用于CHN患兒以保護患者腎功能需要進一步研究。為了更好的從分子水平上了解CHN相關(guān)的腎臟病理生理學(xué)變化和轉(zhuǎn)歸及對可能的治療方法的探索,常需要借助動物實驗研究,大鼠輸尿管梗阻模型已經(jīng)廣泛用于梗阻性腎病及腎間質(zhì)纖維化等方面的研究。臨床上的CHN患兒多數(shù)是部分梗阻,但是在動物模型中部分梗阻程度的均一性不容易控制和量化。輸尿管完全梗阻模型可以克服這些困難,也常被用來研究梗阻引起的腎臟病理生理變化。因此本研究的第三部分用幼鼠輸尿管完全梗阻模型探討了EPO對輸尿管梗阻解除后幼鼠腎臟AQP1-3表達及腎臟功能的影響,并探討其發(fā)揮作用的機制。在腎臟表達的AQP的亞型中,AQP2與尿液濃縮功能的關(guān)系最為最為密切,并且與多種尿液濃縮稀釋功能障礙有關(guān),前期也有研究者發(fā)現(xiàn)EPO可以促進梗阻解除后大鼠腎臟AQP2表達的恢復(fù),但是體內(nèi)影響因素較多,EPO對腎臟集合管細(xì)胞中的AQP2直接調(diào)控作用及其發(fā)揮作用的機制還不清楚。體外研究可以排除體內(nèi)其他因素的干擾,如果在體外EPO能直接上調(diào)AQP2的表達,則可能為EPO治療AQP2相關(guān)的包括先天性腎積水等疾病提供理論依據(jù)。因此本研究的第四部分采用m IMCD-3細(xì)胞系,探討EPO對集合管細(xì)胞中AQP2表達的作用及其機制。綜上所述,本研究主要闡明腎臟水通道蛋白在先天性腎積水腎臟中的表達及EPO對其調(diào)控機制,通過臨床上檢測胚胎時期腎臟中的水通道蛋白正常和異常表達規(guī)律,在動物模型和體外實驗證實EPO對輸尿管梗阻腎臟AQP1-3蛋白表達的調(diào)控機制和腎臟功能的保護作用,主要研究目的和內(nèi)容如下:(1)了解正常和積水腎臟的AQP1-3的表達情況;(2)了解羊水中檢測到的AQP2和胎兒腎臟AQP2表達的關(guān)系;(3)在幼鼠探討EPO對輸尿管梗阻解除后幼鼠腎臟AQP1-3表達及腎功能的影響,并探討其發(fā)揮作用的機制;(4)探討EPO對m IMCD-3細(xì)胞AQP2表達的影響及作用機制。第一部分正常及腎積水人胎兒腎臟AQP1-3的表達材料和方法1.收集引產(chǎn)的正常胎兒腎臟共22例(15-21W組8例;23-28W組8例:30-36W組6例);2.收集引產(chǎn)的腎積水胎兒腎臟7例(32W 4例,34W 3例,病變部位均為單側(cè)),取標(biāo)本前泌尿系彩超發(fā)現(xiàn)胎兒腎臟重度積水;3.陽性對照:正常成人腎組織8例(男6例,女2例,年齡56±4.3歲)來自腎切除經(jīng)手術(shù)后病理證實的腎盂癌旁的正常腎組織;4.利用HE染色技術(shù)檢測胎兒腎臟的形態(tài)學(xué)變化;利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測所有腎組織中AQP1-3蛋白的定位與表達量;利用Real-time PCR技術(shù)檢測所有腎組織中AQP1-3 m RNA的表達;利用Western blot技術(shù)檢測所有腎組織中AQP1-3蛋白的表達量;5.統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗,三組及三組以上的比較采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn),P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.HE染色結(jié)果顯示在妊娠早中期,胎兒腎臟皮質(zhì)部分較少,并且皮質(zhì)中腎小球數(shù)量較少,體積較大,隨著胎齡的增加,腎臟皮質(zhì)部分逐漸發(fā)育,皮質(zhì)中腎小球數(shù)量也逐漸增多;在妊娠早中期,胎兒腎髓質(zhì)中所含腎間質(zhì)組織較多,腎小管稀少,隨著胎齡的增加,腎單位逐漸發(fā)育,髓質(zhì)中的腎小管和毛細(xì)血管逐漸增加。2.免疫組化結(jié)果顯示胎兒腎臟中AQP1-3蛋白表達部位與成人相同,AQP1主要位于腎臟近曲小管和髓袢降支細(xì)段,在腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞也有表達,AQP2主要位于腎臟集合管主細(xì)胞頂端膜;AQP3主要位于腎臟集合管細(xì)胞基底側(cè)膜。隨著胎齡的增加,陽性表達AQP1-3的腎小管數(shù)量逐漸增加,表達強度也逐漸增強,但是在妊娠后期胎兒腎臟AQP1-3的表達強度均弱于成人腎組織。孕晚期腎積水組胎兒腎臟中AQP1-3蛋白的陽性表達程度弱于同孕期正常胎兒腎臟中AQP1-3蛋白的表達。3.RT-PCR結(jié)果顯示隨著胎齡增加,腎組織中AQP1-3的m RNA表達量逐漸增高;15-21W組,23-28W組和30-36W組胎兒腎組織中AQP1-3 m RNA的表達量分別為:AQP1:(13.4±7.3)%Vs.(31.7±5.7)%Vs.(71.1±1.9)%;AQP2:(12.0±2.3)%Vs.(32.2±4.3)%Vs.(78.6±5.6)%;AQP3:(16.1±6.3)%Vs.(47.2±6.3)%Vs.(81.5±3.1)%;P0.05。RT-PCR結(jié)果同時顯示孕晚期腎積水胎兒腎臟中AQP1-3 m RNA的表達量均低于正常胎兒腎臟組:AQP1:(38.3±7.5)%Vs.(70.8±6.2)%;AQP2:(41.2±6.3)%Vs.(76.9±4.3)%;AQP3:(63.6±8.7)%Vs.(81.1±4.6)%;P0.05。4.Western blot結(jié)果同樣顯示隨著胎齡增加,腎組織中AQP1-3的蛋白表達量逐漸增高;15-21W組,23-28W組和30-36W組胎兒腎組織中AQP1-3蛋白的表達量如下:AQP1:0.228±0.10Vs.0.304±0.091Vs.0.543±0.095;AQP2:0.157±0.086Vs.0.269±0.079Vs.0.441±0.011;AQP3:0.152±0.047Vs.0.261±0.086Vs.0.512±0.089;P0.05。Western blot結(jié)果同時顯示孕晚期腎積水胎兒腎臟中AQP1-3蛋白的表達量均低于正常胎兒腎臟組:AQP1:0.281±0.039 Vs.0.449±0.039;AQP2:0.306±0.112Vs.0.567±0.142;AQP3:0.261±0.086 Vs.0.512±0.089;P0.05。第二部分孕期羊水中AQP2與胎兒腎臟中AQP2蛋白表達的關(guān)系研究材料和方法1.收集正常胎兒腎臟標(biāo)本22例(16-21W 8例,24-30W 8例,32-38W 6例)。2.收集正常胎兒羊水24例(16-21W 10例,24-30W 6例,32-38W 8例);同時收集10例健康成年女性(26.0±2.3歲)的晨尿作為陽性對照。3.用Western blot檢測胎兒腎臟中的AQP2蛋白表達量,用酶聯(lián)免疫吸附法檢測羊水中的AQP2,用冰點滲透壓測定儀檢測羊水滲透壓;用全自動生化檢測儀檢測羊水中的鈉,鉀及肌酐和尿素氮濃度。4.統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示;正態(tài)性檢驗用K-S檢驗,多組間比較用單因素方差分析,各組之間的兩兩比較用LSD-t進行檢驗,羊水和腎臟中AQP2的關(guān)系用Pearson相關(guān)性分析進行檢驗,以α=0.05為檢驗水準(zhǔn),P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.Western blot結(jié)果顯示16-21W,24-30W和32-38W胎兒腎臟AQP2蛋白的表達量分別為0.982±0.325Vs.1.556±0.262 Vs.2.06±0.228,組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);2.ELISA結(jié)果顯示16-21W,24-30W和32-38W羊水及成人尿液中檢測到的AQP2濃度分別為(30.243±5.812)mg/L Vs.(35.112±7.265)mg/L Vs.(42.575±1.226)mg/L Vs.(46.513±0.449)mg/L,組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);3.相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),不同孕期羊水中AQP2的水平與對應(yīng)孕期胎兒腎臟中AQP2的表達呈正相關(guān)(r=0.872,P=0.000)。第三部分EPO對幼鼠雙側(cè)輸尿管梗阻解除后腎功能及腎臟AQP1-3蛋白表達的影響材料和方法1.實驗分組:(1)雄性SD幼鼠20只,體重(160±10)g,隨機分為BUO組和sham組,各組n=10。(2)雄性SD幼鼠30只,體重(160±10)g,隨機分為BUO-3R組、BUO-3R+EPO組和sham-3R組,各組n=10。(3)雄性SD幼鼠30只,體重(160±10)g,隨機分為BUO-7R組、BUO-7R+EPO組和sham-7R組,各組n=10。2.動物模型制作:BUO大鼠的制作,待大鼠完全麻醉后,分別暴露出兩側(cè)輸尿管并在跨過髂血管處鈍性分離出一段長約1cm的輸尿管,將一段側(cè)方有開口的長約0.5cm的靜脈輸液針軟管套于分離出的輸尿管上,并用絲線結(jié)扎套管。BUO-R大鼠在梗阻術(shù)后24h再次麻醉,將兩側(cè)輸尿管結(jié)扎的絲線和套管去除。Sham組大鼠僅游離兩側(cè)輸尿管,但不結(jié)扎,其他處理同BUO及BUO-R組大鼠。3.藥物干預(yù):BUO-3R+EPO組大鼠在解除梗阻時及解除梗阻后的第1d和3d時給予EPO腹腔注射;BUO-7R+EPO組大鼠在解除梗阻時及解除梗阻后的第1d,3d,5d和7d時給予EPO腹腔注射,BUO-3R,Sham-3R,BUO-7R和Sham-7R組在相同時間點給予腹腔注射等體積的生理鹽水。4.標(biāo)本收集:BUO組大鼠在梗阻術(shù)后24h取標(biāo)本;BUO-3R,BUO-3R+EPO和Sham-3R組大鼠在梗阻解除后的第3天取標(biāo)本;BUO-7R,BUO-7R+EPO和Sham-7R組大鼠在梗阻解除后的第7天取標(biāo)本。取標(biāo)本時,經(jīng)下腔靜脈采血,用于腎功能的檢測;然后取兩側(cè)腎臟,每個時間點取10只大鼠,各5只大鼠腎臟用于后續(xù)AQP1-3和α-SMA和TGF-?蛋白的western blot檢測;另5只大鼠腎臟用于Masson染色和AQP1-3及α-SMA和TGF-?的免疫組化檢測。5.統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗,三組及三組以上比較采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn),P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.雙側(cè)輸尿管完全梗阻24h后BUO組和sham組的腎功能檢測結(jié)果如下(尿素氮:117.9±3.0 mmol/L Vs.6.9±0.2 mmol/L;肌酐:230±14.7μmol/L Vs.54.3±1.1μmol/L;血漿滲透壓:338.8±3.2 mosmol/kg H2O Vs.293.7±5.2mosmol/kg H2O;血鉀:6.5±0.3 mmol/L Vs.4.4±0.2 mmol/L;差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05)。梗阻解除后的1W內(nèi)大鼠會有明顯的多尿,并且尿液滲透壓較低。2.腎功能檢測結(jié)果顯示在梗阻解除后的第3天,BUO-3R+EPO組,BUO-3R組和Sham-3R組大鼠腎功能檢測結(jié)果如下:尿素氮:21.9±1.1 mmol/LVs.27.1±2.1mmol/L Vs.6.8±0.3mmol/L,P0.05;血肌酐:113.4±3.3μmol/L Vs.134.2±5.4μmol/L Vs.54.1±1.4μmol/L,P0.05;腎功能檢測結(jié)果顯示在梗阻解除后的第7天,BUO-7R+EPO組,BUO-7R組和Sham-7R組大鼠腎功能檢測結(jié)果如下,尿素氮:19.8±1.0 mmol/L Vs.22.9±0.8 mmol/L Vs.6.8±0.2 mmol/L,P0.05;血肌酐:67.7±3.2μmol/L Vs.74.1±3.1μmol/L Vs.54.2±0.7μmol/L,P0.05。3.免疫組化結(jié)果顯示大鼠腎臟中AQP1主要位于腎臟近曲小管和髓袢降支細(xì)段,AQP2主要位于腎臟集合管主細(xì)胞頂端膜;AQP3主要位于腎臟集合管細(xì)胞基底側(cè)膜。在梗阻解除后的第3d,AQP1,AQP2和AQP3的蛋白染色均為Sham-3R組最強,BUO-3R+EPO組次之,BUO-3R組最弱;在梗阻解除后的第7d,AQP1,AQP2和AQP3的蛋白染色也均為Sham-7R組最強,BUO-7R+EPO組次之,BUO-7R組最弱。免疫組化結(jié)果顯示在梗阻解除后的第3d,TGF-?和α-SMA的蛋白染色均為,BUO-3R組最強,BUO-3R+EPO組次之,Sham-3R組最弱;在梗阻解除后的第7d,TGF-?和α-SMA的蛋白染色均為BUO-7R組最強,BUO-7R+EPO組次之,Sham-7R組最弱。4.Masson結(jié)果顯示,在梗阻解除后的第3d,實驗大鼠腎臟中膠原染色BUO-3R組最強,BUO-3R+EPO組次之,Sham-3R組大鼠最弱;在梗阻解除后的第7d,實驗大鼠腎臟中膠原染色BUO-7R組最強,BUO-7R+EPO組次之,Sham-7R組最弱。5.Western blot結(jié)果顯示在梗阻解除后的第3d,BUO-3R+EPO組,BUO-3R組和Sham-3R組大鼠的AQP1,AQP2和AQP3以及TGF-?和α-SMA的表達量分別為,AQP1:(60.1±5.8)%Vs.(35.3±6.3)%Vs.(100±6.6)%;AQP2:(59±7)%Vs.(32±8)%Vs.(100±9)%;AQP3:(62±6.7)%Vs.(48.5±2.2)%Vs.(100±5.9)%;TGF-?1:(109.4±4.4)%Vs.(141.7±5.5)%Vs.(100±3.9)%;α-SMA:(118.6±5.6)%Vs.(132.4±4.2)%Vs.(100±3.1)%,P0.05。Western blot結(jié)果顯示在梗阻解除后的第7d,BUO-7R+EPO組,BUO-7R組和Sham-7R組大鼠的AQP1,AQP2和AQP3以及TGF-?1和α-SMA的表達量分別為,AQP1:(87.8±7.3)%Vs.(41.1±5.6)%Vs.(100±2.3)%;AQP2:(81.8±4)%Vs.(41.1±7)%Vs.(100±3)%;AQP3:(96.7±6.8)%Vs.(49.5±5.1)%Vs.(100±7.4)%;TGF-?:(147.3±2.3)%Vs.(321.3±13.1)%Vs.(100±2.7)%;α-SMA:(158.2±7.5)%Vs.(319.5±8.2)%Vs.(100±4.6)%,P0.05。第四部分EPO通過PI3K/AKT上調(diào)m IMCD-3細(xì)胞中AQP2表達材料和方法1.制作轉(zhuǎn)染AQP2基因的m IMCD-3細(xì)胞系。2.取轉(zhuǎn)染過AQP2的m IMCD-3細(xì)胞進行培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞密度為3×106/ml,每孔加入2ml細(xì)胞懸液,均勻鋪在6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,饑餓24h,然后加入新的培養(yǎng)基,在DMEM培養(yǎng)基中根據(jù)分組分別加入0 IU/ml、5 IU/ml、10 IU/ml、20 IU/ml的EPO,每組處理5個重復(fù),將培養(yǎng)板置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),培養(yǎng)72h后進行免疫熒光和Western blot實驗檢測不同濃度的EPO干預(yù)對AQP2蛋白表達的影響。3.取轉(zhuǎn)染過AQP2的m IMCD-3細(xì)胞進行培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞密度為3×106/ml,每孔加入2ml細(xì)胞懸液,均勻鋪在6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,饑餓24h,然后加入新的培養(yǎng)基,在DMEM培養(yǎng)基中根據(jù)分組分別加入10 IU/ml的EPO,每組處理5個重復(fù),將培養(yǎng)板置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),分別在培養(yǎng)0’,5’,10’,15’,30’,1h,2h,3h,4h和5h組后提取蛋白進行Western blot實驗檢測EPO激活PI3K/AKT通路的最佳時間。4.取轉(zhuǎn)染過AQP2m IMCD-3細(xì)胞進行培養(yǎng),調(diào)整細(xì)胞密度為3×106/ml,每孔加入2ml細(xì)胞懸液,均勻鋪在6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,饑餓24h,然后加入新的培養(yǎng)基,按不同實驗處理共分為4組,空白對照組,EPO組,EPO+LY294002組和LY294002組,每組處理5個重復(fù),將培養(yǎng)板置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),分別在培養(yǎng)30min后提取蛋白進行Western blot實驗檢測PI3K/AKT信號通路激活情況。5.統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗,三組及三組以上比較采用單因素方差分析。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn),P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.免疫熒光結(jié)果顯示,m IMCD-3細(xì)胞中AQP2蛋白主要位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),EPO濃度為10IU/ml時AQP2染色最強。2.和免疫熒光結(jié)果一致,Western blot結(jié)果也顯示,EPO濃度為10IU/ml時m IMCD-3細(xì)胞中AQP2蛋白表達最強;Western blot結(jié)果顯示在EPO給藥30min后,P-AKT表達量最高,Western blot結(jié)果顯示在給藥30min后,EPO+LY294002組的表達量較EPO組低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。結(jié)論1.在發(fā)育過程中,人胎兒腎臟中的AQP1-3蛋白和m RNA均隨胎齡增大,表達量也逐漸增加,其可能與胎兒腎功能逐漸發(fā)育成熟有關(guān);胎兒時期腎積水會使胎兒腎臟中AQP1-3表達下調(diào),這可能會影響胎兒腎臟尿液濃縮功能。2.羊水中檢測到的AQP2蛋白濃度可以在一定程度上反應(yīng)胎兒腎臟中AQP2蛋白的表達水平。3.EPO可以通過抗纖維化作用促進輸尿管梗阻解除后幼鼠腎臟功能及腎臟AQP1-3蛋白表達的恢復(fù)。4.EPO通過PI3K/AKT信號通路上調(diào)m IMCD-3細(xì)胞中AQP2的表達。
【圖文】：

胎齡16+1W胎兒腎組織HE染色結(jié)果

胎齡21+2W胎兒腎組織HE染色結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R714.5

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本文編號：2601430