【摘要】：目的本文旨在探究LSD1在人卵巢癌細(xì)胞自噬中的作用,并揭示其參與自噬過程的具體調(diào)控機制,為探尋新的卵巢癌發(fā)病機制和潛在的分子靶向治療方案提供數(shù)據(jù)支撐和理論基礎(chǔ)。方法1.采用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法用卵巢癌HO8910細(xì)胞株構(gòu)建穩(wěn)定傳代的誘導(dǎo)型敲減LSD1的細(xì)胞模型,Western blotting和qRT-PCR觀察LSD1的敲減程度及其特異性底物H3K4me2水平的變化。2.Western blotting方法檢測敲減LSD1表達(dá)和抑制LSD1酶活性對自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3蛋白表達(dá)的影響。3.qRT-PCR檢測敲減和抑制LSD1對自噬相關(guān)基因LC3 mRNA表達(dá)水平的影響。4.免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence)觀察敲低LSD1表達(dá)或抑制LSD1酶活性后內(nèi)源性LC3的表達(dá)及聚集變化,進(jìn)而探討LSD1與細(xì)胞自噬發(fā)生的關(guān)系。5.GFP-LC3單熒光體系示蹤技術(shù)將GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入LSD1敲低或抑制的HO8910細(xì)胞株內(nèi),觀察GFP-LC3為代表的外源性自噬小體的聚集情況。6.無血清的DMEM(饑餓)和雷帕霉素(Rapamycin)誘導(dǎo)HO8910細(xì)胞自噬發(fā)生,利用Western blotting檢測在自噬狀態(tài)下LSD1的表達(dá)變化,進(jìn)一步佐證LSD1在卵巢癌細(xì)胞自噬中的作用。7.Western blotting檢測敲減LSD1表達(dá)對mTOR活性的影響,然后利用mTOR的激活劑MHY1485激活mTOR信號,進(jìn)一步檢測LSD1調(diào)控細(xì)胞自噬與mTOR信號通路的依賴關(guān)系,從而探討LSD1影響卵巢癌細(xì)胞自噬的作用機制。結(jié)果1.本研究通過慢病毒介導(dǎo)在卵巢癌HO8910細(xì)胞株內(nèi)穩(wěn)定誘導(dǎo)敲低LSD1的方法效果顯著,在Dox誘導(dǎo)下,LSD1的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄(mRNA)和翻譯(蛋白質(zhì))水平均顯著降低,且降低程度與Dox呈時間劑量依賴性方式;相反,LSD1的特異性甲基化底物H3K4me2的表達(dá)水平顯著增高,表明誘導(dǎo)型穩(wěn)定敲低LSD1表達(dá)的HO8910細(xì)胞株成功建立,為后續(xù)實驗提供了穩(wěn)定高效的細(xì)胞模型。2.Western blotting結(jié)果顯示敲低LSD1表達(dá)或抑制LSD1酶活性導(dǎo)致自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ蛋白水平顯著升高,且蛋白升高的趨勢與Dox呈時間劑量依賴性方式,而并不影響另一自噬相關(guān)蛋白Beclin1的蛋白表達(dá)。另外,qRT-PCR結(jié)果顯示,LSD1表達(dá)或酶活性受抑后,LC3 mRNA表達(dá)水平并無變化。3.Western blotting和免疫熒光結(jié)果顯示LSD1的敲低或抑制顯著誘導(dǎo)HO8910細(xì)胞自噬的發(fā)生。4.血清饑餓和雷帕霉素誘導(dǎo)自噬發(fā)生后,HO8910細(xì)胞內(nèi)LSD1蛋白的表達(dá)被明顯抑制;用Dox誘導(dǎo)LSD1下調(diào)后,導(dǎo)致饑餓和雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬通量進(jìn)一步累積,提示LSD1可能涉及饑餓和雷帕霉素誘導(dǎo)自噬的過程,且LSD1的表達(dá)受到饑餓或雷帕霉素這兩種自噬刺激因素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。5.LSD1的下調(diào)或抑制可以引起mTOR信號通路失活,從而導(dǎo)致細(xì)胞自噬水平上調(diào),用MHY1485激活mTOR信號后,LSD1下調(diào)所導(dǎo)致的自噬激活被阻斷,表明LSD1下調(diào)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬是通過抑制mTOR信號通路實現(xiàn)的。結(jié)論1.LSD1在卵巢癌HO8910細(xì)胞中負(fù)向調(diào)控細(xì)胞自噬的發(fā)生;2.通過sh RNA技術(shù)敲低LSD1或藥物性抑制LSD1酶活性能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生,刺激自噬流的累積;3.干擾LSD1表達(dá)顯著增強饑餓或雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬,且LSD1的表達(dá)受自噬刺激因素的負(fù)反饋調(diào)節(jié);4.LSD1調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞自噬的過程依賴于對mTOR信號通路的調(diào)控。
【圖文】：

1.2.1 LSD1 概述組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶 1（LSD1）是首個被證實的組蛋白去甲基化酶[20]，它是一種進(jìn)化上比較保守的、FAD依賴的胺氧化酶家族的成員之一[21]，主要有三個晶體結(jié)構(gòu)域組成：N端的SWIRM結(jié)構(gòu)域、C端的AOL結(jié)構(gòu)域和位于AOL-N端與C端中間的Tower 結(jié)構(gòu)域 (圖1.1A)。其中SWIRM結(jié)構(gòu)域用于蛋白質(zhì)間相互作用；AOL結(jié)構(gòu)域主要調(diào)控LSD1與其底物結(jié)合，對于LSD1發(fā)揮其特異性去甲基化功能至關(guān)重要；Tower結(jié)構(gòu)域可維持AOL的空間構(gòu)型，若Tower結(jié)構(gòu)域堿基缺失或突變可直接導(dǎo)致LSD1的活性喪失[22, 23]。LSD1的主要功能體現(xiàn)為：在FAD的催化下，能特異性催化和移除組蛋白H3第4位賴氨酸K4(H3K4) 的單甲基（me1）和二甲基（me2）修飾；在雄激素的誘導(dǎo)下，LSD1能特異性去除H3K9me1/2的甲基修飾，使其恢復(fù)未甲基狀態(tài)，從而影響靶基因結(jié)構(gòu)功能的改變導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄激活或失活[20, 24](圖1.1B)。

中研究的自噬的類型[36]，，見圖1.2。圖1.2 自噬小體的形成模式圖[37]Fig 1.2 The formation of autophagosomes[37]1.3.2 自噬與腫瘤的關(guān)系由于自噬的主要生理功能是清除受損衰老的細(xì)胞器，防止有害物質(zhì)的堆積，并為機體的平穩(wěn)運行提供代謝所需底物和能量，因此細(xì)胞內(nèi)保持一個正常低水平的自噬有利于細(xì)胞抵抗環(huán)境、病原體入侵等壓力，延長細(xì)胞的壽命。腫瘤形成早期時，自噬有利于機體抵抗外源入侵的有害物質(zhì)，清除腫瘤形成灶，抵抗和抑制腫瘤的發(fā)生[38]。眾多報道發(fā)現(xiàn)，在人類的許多難治性疾病例如帕金森海默癥、腫瘤等組織細(xì)胞中都伴隨自噬水平受損低下或缺陷的現(xiàn)象[39]。隨著腫瘤組織的形成壯大，自噬此時又有助于幫助腫瘤細(xì)胞度過高代謝導(dǎo)致的營養(yǎng)缺乏的危機、清除由于腫瘤組織的高破壞性導(dǎo)致的正常組織細(xì)胞凋亡壞死的碎片、協(xié)助腫瘤細(xì)胞躲過機體免疫監(jiān)視，推進(jìn)腫瘤的發(fā)展[33]。報道稱
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 Laura Lattanzio;Cristiana Lo Nigro;;Epigenetics and DNA methylation in cancer[J];World Journal of Translational Medicine;2015年01期

2 陳慧;周思園;孫振球;;常見婦科三大惡性腫瘤的流行及疾病負(fù)擔(dān)研究現(xiàn)狀[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2015年06期

3 徐近;秦毅;張波;吉順榮;許文彥;施思;劉江;虞先o

本文編號：2597788