【摘要】：卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一,因其起病較隱匿、轉(zhuǎn)移性強、預(yù)后差,發(fā)病率和死亡率均位居婦科惡性腫瘤前列。近年來,隨著卵巢癌的診斷和治療方法的新進展使早期發(fā)現(xiàn)的患者長期存活率有了較明顯改觀。然而,由于卵巢癌臨床癥狀不明顯,大多數(shù)患者被診斷時已為已有卵巢癌盆腔轉(zhuǎn)移或淋巴轉(zhuǎn)移,患者預(yù)后極差,且死亡率高,5年生存率低于40%。目前,卵巢癌細(xì)胞減滅術(shù)及手術(shù)后輔以鉑類藥物聯(lián)合紫杉醇為主的一線化療是卵巢癌臨床治療的標(biāo)準(zhǔn)方案,但隨著腫瘤藥物化療敏感性的降低及耐藥情況增加,現(xiàn)行的卵巢癌臨床化療效果卻不甚理想。盡管許多臨床醫(yī)生和研究學(xué)者都在尋求更有效的新治療手段和治療藥物中進行了許多有益的探索和嘗試,然而卵巢癌患者的生存率依然未獲得有效改觀。因此,在不同層面對卵巢癌發(fā)生發(fā)展進行相關(guān)研究,尋找到特異性強的基因靶點、有效的治療手段和治療藥物迫在眉睫。鈣蛋白酶(Calpains)是一種高度保守的鈣依賴型非溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族,其選擇性催化參與各種細(xì)胞過程(包括遷移、運動、增殖和凋亡)特異性底物蛋白的水解。目前,已有15種鈣蛋白酶表型在哺乳動物中被鑒定。其中,Capn4作為鈣蛋白酶蛋白水解系統(tǒng)中重要的小調(diào)節(jié)亞基,在維持鈣蛋白酶-1(Calpain-1)和鈣蛋白酶-2(Calpain-2)穩(wěn)定性和活性中具有極其重要的作用。諸多研究證實鈣蛋白酶在多種惡性腫瘤中高表達(dá),且與腫瘤患者的惡性程度和預(yù)后關(guān)系密切。然而,在本研究實施前尚未見學(xué)者對Capn4在卵巢癌組織中的表達(dá)及其具體機制進行全面和深入的研究。無法了解Capn4在卵巢癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中可能承擔(dān)的角色,其是否可作為卵巢癌潛在的預(yù)后和早期診斷或早期治療的基因靶點值得深入研究。因此,我們本研究目的旨在考察Capn4在卵巢癌組織中的表達(dá)情況,闡明Capn4表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性,探討其在卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲以及遷移中的作用及可能的分子機制,并進一步研究Capn4對卵巢癌順鉑化療敏感性的影響及相關(guān)作用機制,以期明確Capn4在提高卵巢癌順鉑化療藥物的敏感性,改善患者預(yù)后的作用,最終為以Capn4的靶向治療提供更多新的實驗依據(jù)。第一部分Capn4在卵巢癌組織中的表達(dá)及其預(yù)后相關(guān)性研究目的:檢測Capn4基因在卵巢癌組織中的表達(dá)水平,分析Capn4在卵巢癌組織中表達(dá)差異與卵巢癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系,并考察其與卵巢癌患者的預(yù)后相關(guān)性。方法:選擇在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治確診并進行手術(shù)切除、病理診斷確診為卵巢癌的組織標(biāo)本113例作為研究組,癌旁正常組織35例作為對照組,采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)、Western-blot及免疫組化的實驗方法,分別檢測Capn4的mRNA、蛋白的表達(dá)水平以及陽性表達(dá)情況;采用卡方檢驗方法分析Capn4表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性,并通過對入選卵巢癌患者進行5年總生存期隨訪;運用Kaplan-Meier生存曲線分析Capn4表達(dá)情況與無疾病進展生存期及總生存期之間的關(guān)系;運用單因素及多因素Cox回歸分析方法確定Capn4表達(dá)能否作為卵巢癌患者總生存期預(yù)后的危險因素。結(jié)果:與癌旁正常組織比較,卵巢癌組織中Capn4的mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著升高(p0.05),卵巢癌組織中高表達(dá)組Capn4表達(dá)顯著高于低表達(dá)組(P=0.0054);卡方檢驗分析結(jié)果顯示Capn4表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)FIGO分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分級呈正相關(guān)(P0.05);Kaplan-Meier生存曲線分析證實Capn4表達(dá)與卵巢癌患者無疾病進展生存期及總生存期之間呈負(fù)相關(guān),Capn4高表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后較差(P=0.006);Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)Capn4的表達(dá)可以作為卵巢癌患者預(yù)后的一個獨立危險因素(HR=2.157,95%CI:1.091-3.138,P=0.014)。結(jié)論:Capn4在卵巢癌組織中異常表達(dá)與卵巢癌惡性程度成正相關(guān),且與患者的不良預(yù)后關(guān)系密切,Capn4可作為卵巢癌患者預(yù)后的獨立危險因素。第二部分Capn4對卵巢癌生物學(xué)行為的影響及機制研究目的:觀察和評估Capn4對卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲及遷移等生物學(xué)行為產(chǎn)生的影響,并探討其可能的作用機制。方法:采用qRT-PCR方法檢測Capn4在不同級別的卵巢癌細(xì)胞(A278、SKOV3、OVCAR-3)與正常卵巢上皮細(xì)胞HOSEPIC的表達(dá)情況;采用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞系中Capn4的表達(dá),應(yīng)用qRT-PCR、Western-blot方法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾RNA后Capn4在卵巢癌細(xì)胞中的干擾表達(dá)效率;運用MTS實驗、克隆形成實驗、細(xì)胞侵襲實驗、劃痕實驗、流式細(xì)胞術(shù)等實驗方法,檢測卵巢癌細(xì)胞株中Capn4-siRNA瞬時干擾后Capn4的表達(dá),分別觀察和評價Capn4對卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲以及遷移的影響;并進一步采用Western blot方法檢測Capn4干擾表達(dá)后與細(xì)胞周期、凋亡、侵襲、遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,以探索其對生物學(xué)行為影響可能的分子機制。結(jié)果:與正常卵巢上皮細(xì)胞比較,在不同卵巢癌細(xì)胞(A278、SKOV3、OVCAR-3)中Capn4表達(dá)均顯著升高(P0.05);在卵巢癌SKOV3、OVCAR-3細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染干擾序列Capn4-siRNA后,與空白組比較,Capn4-siRNA組中Capn4表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05);體外細(xì)胞實驗研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)瞬時轉(zhuǎn)染Capn4-siRNA干擾序列后,Capn4抑制表達(dá)能顯著降低卵巢癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞克隆能力,并促進卵巢癌細(xì)胞的凋亡;Capn4抑制表達(dá)可降低卵巢癌細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin-D1、CDK4、p-Rb的表達(dá),使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1。Capn4抑制表達(dá)可影響基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Vimentin、E-cadherin的表達(dá),使卵巢癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程受阻,抑制其侵襲遷移。結(jié)論:Capn4在卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá);干擾Capn4的表達(dá)可顯著降低卵巢癌細(xì)胞的增值、侵襲與遷移能力,促進細(xì)胞凋亡。第三部分Capn4影響卵巢癌順鉑化療敏感性的研究目的:初步探討Capn4表達(dá)對卵巢癌順鉑化療敏感性的影響及其可能的作用機制。方法:運用siRNA瞬時干擾技術(shù)沉默卵巢癌細(xì)胞(SKOV3、OVCAR-3)中Capn4的表達(dá),采用MTS實驗方法檢測并評估Capn4對卵巢癌中順鉑化療敏感性,并使用流式細(xì)胞術(shù)對其結(jié)果進行驗證;采用western-blot方法對Capn4影響順鉑在卵巢癌化療藥物敏感性的作用機制進行檢測和初步探討。結(jié)果:干擾卵巢癌細(xì)胞(SKOV3、OVCAR-3)中Capn4的表達(dá)后,和對照組相比,卵巢癌細(xì)胞增殖能力顯著下降,順鉑的IC50值明顯降低,差異具有顯著性(P0.05)。隨后的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,相對于對照組,Capn4抑制表達(dá)后順鉑導(dǎo)致的卵巢癌細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯的增加;此外,順鉑對Capn4的表達(dá)呈現(xiàn)濃度和時間雙重依賴性。Capn4抑制可導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3及Bax蛋白的上調(diào)表達(dá),Bcl-2及核苷酸切除修復(fù)相關(guān)蛋白ERCC1的表達(dá)降低,從而提高了順鉑在卵巢癌細(xì)胞中的化療敏感性。結(jié)論:Capn4抑制表達(dá)可提高順鉑在卵巢癌細(xì)胞(SKOV3、OVCAR-3)中的藥物敏感性,其可能的作用機制是通過Capn4的表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2及核苷酸切除修復(fù)相關(guān)蛋白ERCC1表達(dá)。
【圖文】：

諸多的研究結(jié)果提示鈣蛋白酶異�；罨赡苁菍�(dǎo)致腫瘤發(fā)生及發(fā)展的重要特征，基于 Capn4 作為鈣蛋白酶家族重要成員在調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演的重要角色，我們有理由相信 Capn4 具有成為惡性腫瘤診斷及基因治療中一個重要的新型預(yù)測腫瘤預(yù)后分子標(biāo)記物的潛質(zhì)。因此，大量 Capn4 與腫瘤相關(guān)的研究工作為本研究探討 Capn4 與卵巢癌之間相關(guān)性的創(chuàng)新性研究設(shè)計提供了豐富的理論依據(jù)，并為卵巢癌可能的新治療靶點的發(fā)現(xiàn)提供了新的研究思路及實施的可行性。因此，本研究主要分為三個研究部分，從不同層面圍繞 Capn4 與卵巢癌之間的關(guān)系開展研究設(shè)計和實施，第一部分我們擬使用熒光實時定量 PCR、Western-Blot 及免疫組化方法，，檢測卵巢癌患者術(shù)后卵巢癌組織標(biāo)本中 Capn4的表達(dá)，初步探討 Capn4 表達(dá)與卵巢癌患者的臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，從整體層面證實 Capn4 是否可作為卵巢癌預(yù)后的一個獨立危險因素。第二部分從細(xì)胞分子層面檢測卵巢癌細(xì)胞中 Capn4 的表達(dá)，通過運用 RNA 干擾技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染 siRNA-Capn4 干擾卵巢癌細(xì)胞中 Capn4 的表達(dá)后，分別采用 MTS 實驗、平板克隆形成、劃痕實驗、Transwell、細(xì)胞周期分析等實驗方法探討 Capn4 干擾表達(dá)后對卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移、細(xì)胞周期及凋亡的影響，并考察其可

15圖 1-1 Capn4 在卵巢癌與癌旁正常組織中 mRNA 的表達(dá)組織與癌旁正常組織中 Capn4 的 mRNA 表達(dá)水平差異顯著(* p < 0.01)；O 分期 Capn4 的 mRNA 表達(dá)，高級別組、低級別分別與對照組 Capn4 的高（高級別組 VS 低級別組、對照組，P < 0.01；低級別組 VS 對照組，n4 表達(dá)水平與卵巢癌患者臨床病理因素的相關(guān)性分析卵巢癌組織中 Capn4 的 mRNA 表達(dá)量將卵巢癌組織標(biāo)本進n4低表達(dá)組和Capn4高表達(dá)組，采用卡方檢驗方法分析Capn4 與卵巢癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示，Capn4 FIGO 分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分級存在正相關(guān)（P < 0.05），度越高，Capn4 的表達(dá)越高。而 Capn4 的表達(dá)與患者年齡、大小相關(guān)性不大，結(jié)果如表 1-6 所示。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 沈孝青;程文俊;;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在卵巢癌中的研究進展[J];現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展;2015年05期

2 山長亮;張帥;張曉東;葉麗虹;;乙肝病毒X蛋白突變體(HBxΔ127)通過ERK上調(diào)鈣蛋白酶小亞基1促進肝癌細(xì)胞遷移[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報;2011年05期

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本文編號：2592074