【摘要】：第一部分二甲雙胍抑制卵巢癌的惡性進(jìn)展目的:明確二甲雙胍對卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響方法:1.在卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、A2780、ES2中,建立正常葡萄糖濃度(5.5 m M)及高葡萄糖濃度(25 m M)細(xì)胞培養(yǎng)模型。2.給予卵巢癌細(xì)胞10 m M二甲雙胍24 h,采用Ed U實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測增殖的改變,Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡的改變,劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測遷移的改變。3.給予卵巢癌細(xì)胞10 m M二甲雙胍24 h,采用PCR技術(shù)檢測MMP 11,Caspase 3,Caspase 7,Caspase 9,Bax,bcl-2 m RNA水平。結(jié)果:1.二甲雙胍抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。1)在正常糖條件下,與空白對照組相比,二甲雙胍給藥組SKOV3,A2780和ES2細(xì)胞的增殖率分別下降9.1%(PSKOV3=0.0023),33.37%(PA27800.0001)和34.7%(PES2=0.0010);2)在高糖條件下,與空白對照組相比,二甲雙胍給藥組SKOV3,A2780和ES2細(xì)胞的增殖率分別下降6.55%(PSKOV3=0.0043),38.72%(PA27800.0001)和33.96%(PES2=0.0004);3)與高糖組相比,二甲雙胍對正常糖組卵巢癌細(xì)胞增殖能力的抑制更加明顯(PSKOV3=0.0020,PA2780=0.0009,PES2=0.0467)。2.二級雙胍促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。1)在正常糖條件下,與空白對照組相比,給予二甲雙胍后SKOV3,ES2細(xì)胞的凋亡率顯著增加(PSKOV3=0.0152,PES2=0.0051)。2)與高糖組相比,給予二甲雙胍后正常糖組的所有三種卵巢癌細(xì)胞系均表現(xiàn)出較高的細(xì)胞凋亡率(PSKOV3=0.0051,PA2780=0.0245,PES2=0.0062)。3.二甲雙胍抑制卵巢癌細(xì)胞遷移。1)在正常糖條件下,與空白對照組相比,給予二甲雙胍后卵巢癌細(xì)胞的劃痕愈合能力明顯降低(PSKOV3=0.0334,PA2780=0.0024,PES2=0.0004),且遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(PSKOV3=0.0044,PA2780=0.0001,PES2=0.0001)。2)在高糖條件下,與空白對照組相比,給予二甲雙胍后SKOV3、ES2細(xì)胞的劃痕愈合能力降低(PSKOV3=0.0052,PES2=0.0120),且遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目減少(PSKOV3=0.009,PES2=0.0006)。3)與高糖組相比,給予二甲雙胍后正常糖組的所有三種卵巢癌細(xì)胞系均表現(xiàn)出較低的劃痕愈合能力(PSKOV3=0.0207,PA2780=0.0056,PES2=0.0263),且遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(PSKOV3=0.0480,PA27800.0001,PES2=0.0002)。4.在正常糖條件下,與空白對照組相比,給予2.5 m M二甲雙胍后卵巢癌細(xì)胞SKOV3、ES2凋亡率并無明顯改變(PSKOV3=0.5252,PES2=0.4476);而劃痕愈合能力明顯降低(PSKOV3=0.0193,PES2=0.0349)。5.在正常糖條件下,與空白對照組相比,給予二甲雙胍后卵巢癌細(xì)胞SKOV3的MMP11 m RNA水平降低,Caspase 7、Caspase 9、Bax m RNA水平增加(PMMP11=0.0245,PCaspase 7=0.0486,PCaspase 9=0.0225,PBax=0.0366);Caspase 3 m RNA水平增加8倍以上,但P=0.6172,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:二甲雙胍能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移能力、促進(jìn)其凋亡能力。降低葡萄糖濃度能夠增強(qiáng)二甲雙胍的抗腫瘤效果。第二部分二甲雙胍通過降低H3K27me3水平抑制卵巢癌的惡性進(jìn)展目的:明確二甲雙胍是否通過調(diào)節(jié)組蛋白3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27me3)影響卵巢癌的惡性進(jìn)展。方法:1.給予SKOV3、A2780、ES2細(xì)胞不同濃度(0、2.5、5、10 m M)二甲雙胍,采用western blot技術(shù)檢測H3K27me3、多梳抑制復(fù)合體2(PRC2)的三個(gè)主要組成蛋白Zeste基因增強(qiáng)子的同源基因(EZH2)、Zeste抑制子12(SUZ12)、胚胎外胚層發(fā)育因子(EED)蛋白水平,采用PCR技術(shù)檢測EZH2、SUZ12、EED m RNA水平。2.SKOV3、ES2細(xì)胞轉(zhuǎn)染攜帶EZH2過表達(dá)慢病毒載體,篩選單克隆,建立EZH2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和空載體陰性對照。3.EZH2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和陰性對照細(xì)胞使用5 m M二甲雙胍處理24 h,采用Ed U實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測增殖能力,Annexin V-PE/7-AAD流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡,劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測遷移能力。結(jié)果:1.二甲雙胍降低卵巢癌細(xì)胞H3K27me3蛋白水平。1)在正常糖條件下,與空白對照組相比,給予二甲雙胍后三種卵巢癌細(xì)胞株H3K27me3水平均明顯下降,且這種降低隨著二甲雙胍濃度的增加更加明顯;2)在高糖條件下,與空白對照組相比,給予二甲雙胍后SKOV3細(xì)胞H3K27me3水平輕微降低。2.二甲雙胍降低卵巢癌細(xì)胞EZH2、EED、SUZ12水平。1)在正常糖條件下,與空白對照組相比,給予二甲雙胍后三種卵巢癌細(xì)胞株EZH2、SUZ12、EED m RNA及蛋白水平均明顯降低,且這種降低隨著二甲雙胍濃度的增加更加明顯,而高糖條件下,二甲雙胍對卵巢癌細(xì)胞EZH2、SUZ12、EED m RNA及蛋白水平的抑制并不明顯。2)在高糖條件下,給予二甲雙胍后SKOV3細(xì)胞EED m RNA水平降低,但其蛋白水平并無明顯改變;且在二甲雙胍處理?xiàng)l件下SKOV3細(xì)胞SUZ12蛋白水平降低,但其m RNA水平并無明顯改變,提示二甲雙胍對卵巢癌細(xì)胞PRC2的影響可能存在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。3.上調(diào)H3K27me3逆轉(zhuǎn)二甲雙胍對卵巢癌的抑制。1)與陰性對照細(xì)胞相比,EZH2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株H3K27me3蛋白水平明顯增加。2)與陰性對照細(xì)胞相比,EZH2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株增殖率增加(PSKOV3=0.0243,PES2=0.0009),劃痕愈合能力增強(qiáng)(PSKOV3=0.0063)、遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目增加(PSKOV3=0.0360,PES2=0.0232)。3)在陰性對照細(xì)胞中,與空白對照組相比,給予二甲雙胍后卵巢癌細(xì)胞增殖率降低(PSKOV3=0.0004,PES2=0.0009)、劃痕愈合能力減弱(PSKOV3=0.0028),遷移至下室的細(xì)胞數(shù)目減少(PSKOV3=0.0109,PES2=0.0102),凋亡率增加(PSKOV3=0.0350,PES2=0.0286);4)在EZH2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中,與空白對照組相比,給予二甲雙胍后卵巢癌細(xì)胞增殖率、凋亡率、劃痕愈合能力及遷移至下室細(xì)胞數(shù)目均無明顯改變(P0.05)。結(jié)論:二甲雙胍抑制卵巢癌細(xì)胞PRC2功能,且二甲雙胍通過降低H3K27me3水平抑制卵巢癌的惡性進(jìn)展。第三部分二甲雙胍通過AMPK途徑抑制H3K27me3水平目的:明確二甲雙胍是否通過AMPK途徑降低H3K27me3。方法:1.給予卵巢癌細(xì)胞SKOV3、A2780、ES2不同濃度(0、2.5、5、10 m M)二甲雙胍24 h,采用western blot技術(shù)檢測AMPK、P-AMPK蛋白水平。2.給予SKOV3、ES2細(xì)胞另一種AMPK激活劑2-DG(25 m M)24 h,采用western blot技術(shù)檢測AMPK、P-AMPK、H3K27me3、PRC2蛋白水平。3.用AMPK抑制劑Compound C(20μM)預(yù)處理SKOV3、ES2細(xì)胞2 h,再給予5 m M二甲雙胍24 h,采用western blot技術(shù)檢測AMPK、P-AMPK、H3K27me3、PRC2蛋白水平。結(jié)果:1.二甲雙胍在卵巢癌細(xì)胞中激活A(yù)MPK。1)正常糖培養(yǎng)條件下,與空白對照組相比,給予二甲雙胍后SKOV3、A2780、ES2細(xì)胞P-AMPK/AMPK比例明顯增加,且這種增加趨勢隨著二甲雙胍濃度的增加更加明顯;2)而高糖培養(yǎng)條件下,與空白對照組相比,給予二甲雙胍后SKOV3、A2780、ES2細(xì)胞P-AMPK/AMPK比例僅有輕微增加。2.與對照組相比,給予2-DG后SKOV3、ES2細(xì)胞P-AMPK/AMPK比例增加,H3K27me3、EZH2、SUZ12、EED蛋白水平降低。3.與空白對照組相比,二甲雙胍與Compoud C聯(lián)合用藥組P-AMPK/AMPK比例不再增加;且與二甲雙胍單藥組相比,二甲雙胍與Compoud C聯(lián)合用藥組H3K27me3、EZH2、SUZ12、EED蛋白水平增加。結(jié)論:二甲雙胍通過激活A(yù)MPK降低H3K27me3水平。
【圖文】：

32圖 1. EdU 增殖實(shí)驗(yàn)檢測給予 10 mM 二甲雙胍 24 h 后卵巢癌細(xì)胞 SKOV3、A2780、ES2 增殖能力。（A、C、E 圖）為熒光顯微鏡放大 100×采集的圖像。紅色 EdU 染色顯示的是增殖細(xì)胞，藍(lán)色 Hoechst 染色顯示的是總的細(xì)胞。Merge 是將兩張圖像濾色融合之后的圖像。（B、D、F 圖）為統(tǒng)計(jì)學(xué)分析圖表。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.2、二甲雙胍促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡。AnnexinV-FITC / PI 流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，在正常糖培養(yǎng)條件下，與空白對照組相比，給予 10 mM 二甲雙胍 24 h 后，SKOV3 和 ES2 細(xì)胞的凋亡率顯著增加

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文（PSKOV3=0.0152，PES2=0.0051），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與 25 mM 葡萄糖濃度組相比，，在 5.5 mM 葡萄糖濃度培養(yǎng)條件下，給予二甲雙胍的所有三種卵巢癌細(xì)胞系均表現(xiàn)出較高的細(xì)胞凋亡率（PSKOV3=0.0051，PA2780=0.0245，PES2=0.0062），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖 2）。以上結(jié)果提示二甲雙胍能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，降低葡萄糖濃度增強(qiáng)二甲雙胍對卵巢癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R737.31

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本文編號：2590393