發(fā)布時間：2020-03-19 02:02

【摘要】：研究背景:卵巢癌在婦科惡性腫瘤的死亡人數(shù)中排名第一。據(jù)預測,美國約13980名卵巢癌患者將于2019年喪生。卵巢癌的治療以手術和術后化療藥物的綜合治療為主,但復發(fā)率仍居高不下,超過85%。由于耐藥性的出現(xiàn),影響EOC的PFS和OS。因此,關于如何逆轉卵巢癌耐藥分子機制的研究引起人們廣泛關注。Curcumin,來自一個黃色的飲食風味的植物(姜黃),據(jù)報道對卵巢癌有治療作用,并進行了臨床試驗發(fā)現(xiàn)具有誘導腫瘤細胞凋亡的效應。有研究報道Curcumin可誘導癌細胞凋亡性死亡,發(fā)揮抗癌作用,然而,在EOC治療中,Curcumin的耐藥性限制了臨床應用。最近的研究表明,Curcumin在癌癥細胞中表現(xiàn)的耐藥性與自噬密切相關。細胞內(nèi)自噬是為了維持體內(nèi)環(huán)境的平衡。研究結果表明,Curcumin誘導的自噬不僅是促進死亡信號,也是一種對應激的適應,以避免細胞死亡和細胞凋亡,導致化療耐藥。研究表明卵巢癌在藥物中表現(xiàn)的耐藥性與自噬的保護作用有關。Curcumin在各種癌癥研究中被確認為自噬誘導因子,如黑色素瘤、膠質瘤、乳腺癌和口腔癌。因此,抑制自噬可能是克服Curcumin對卵巢癌耐藥障礙的有效途徑。自噬抑制劑,如氯喹(CQ),與化療藥物和放療聯(lián)合使用時具有增強抗腫瘤作用,提示其在抗癌治療中具有重要作用。因此,自噬抑制劑對于解決Curcumin在卵巢癌的耐藥性有著巨大的潛力。本課題探討了 Curcumin在治療卵巢癌細胞發(fā)生耐藥的分子機制。研究自噬的保護作用在Curcumin發(fā)生耐藥中的關鍵作用,探討使用自噬抑制劑是否可以逆轉Curcumin在卵巢癌發(fā)生耐藥的機制。研究目的:本課題探討了 Curcumin在治療卵巢癌細胞發(fā)生耐藥的分子機制。研究自噬的保護作用在Curcumin發(fā)生耐藥中的關鍵作用,探討使用自噬抑制劑是否可以逆轉Curcumi n在卵巢癌發(fā)生耐藥的機制。研究材料:在本研究中,SK-OV-3和A2780人卵巢癌上皮性細胞株購自ATCC。HO-8910人卵巢癌上皮性細胞系和HEK-293T人胚腎細胞系購自中國科學院(上海)。SK-OV-3和A2780通過轉染后經(jīng)嘌呤霉素篩選構建敲減LC3B的穩(wěn)定SK-OV-3-pLKO.1-shLC3B和A2780-pLKO.1-shLC3B細胞株,同時建立與之對應的對照細胞株SK-OV-3-pLKO.1-NC和A2780-pLKO.1-NC。研究方法:MTT測定法、EdUU細胞增殖測定法、細胞集落形成測定法以及流式細胞檢測不同濃度Curcumin作用SK-OV-3和A2780在各個時間點的細胞活力。Curcumin對SK-OV-3和A2780細胞中凋亡相關蛋白表達用Western blot檢測。電鏡下觀察A2780細胞自噬囊泡、熒光顯微鏡下觀察自噬標記LC3免疫熒光檢測SK-OV-3和A2780細胞自噬體等方法驗證Curcumin處理后的SK-OV-3和A2780細胞系存在自噬作用。應用PI3K抑制劑LY294002以及質粒構建過表達AKT的SK-OV-3細胞系,Cur cumi n誘導SK-OV-3和A2780細胞發(fā)生的自噬保護作用與自噬相關的AKT/mTOR/p70S6K信號通路中靶蛋白分子有相關性由Western blot確認。自噬抑制劑氯喹及shRNA穩(wěn)定敲除自噬靶點分子LC3B作用后,通過MTT測定法、EdU細胞增殖試驗法、流式細胞術及Western blot反向證明Curcumin在SK-OV-3和A2780細胞系上的自噬誘導。統(tǒng)計軟件SPSS 23.0分析實驗數(shù)據(jù),P0.05統(tǒng)計學有差異。所有結果均為三次獨立性實驗所得,結果表示為mean和SD。研究結果:1.Curcumin對SK-OV-3、A2780和HO-8910細胞活力的影響MTT法檢測Curcumin對SK-OV-3、A2780和H0-8910細胞活力的影響:Curcumin(0、5、10、20、40、80μM)處理24h、48h和72h對SK-OV-3、A2780和HO-8910細胞的生長抑制作用,結果顯示Curcumin降低了三種卵巢癌細胞系SK-OV-3、A2780和H0-8910的細胞活力,生長抑制以濃度依賴性和時間依賴性方式表現(xiàn),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Curcurmin的IC50值:SK-OV-3細胞系在24h、48h和72 h分別為41.05、31.84和30.29μM;A2780細胞系在24h、48h和72h分別為18.37、13.26和13.83 μM;HO-8910細胞系在24h、48h和72h分別為18.93、14.46和13.92 μM。細胞集落形成實驗用于觀察Curcumin對EOC細胞增殖的長期抑制。10 μM濃度的Curcumin明顯抑制SK-OV-3細胞系的克隆形成能力。EdU細胞增殖試驗用于驗證Curcumin是否對細胞增殖有直接作用,在SK-OV-3細胞中,用Curcumin處理48h后,EdU的攝取率明顯受到抑制且呈濃度依賴性,表明Curcumin對SK-OV-3、A2780和H0-8910卵巢癌細胞系具有殺傷作用。差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.Curcumin對SK-OV-3和A2780卵巢癌細胞凋亡的影響采用流式細胞儀檢測SK-OV-3和A2780細胞凋亡:Curcumin30 μ M就可以顯著誘導A2780細胞系的細胞凋亡,濃度到達40μM后,能顯著誘導SK-OV-3細胞系的細胞凋亡,差異有統(tǒng)計學意義,P0.05。應用Western blot分析Curcumin對Caspase和PARP活性的影響,顯示Curcumin激活了Caspase-9和PARP,提示EOC細胞中Caspase活化引起的細胞凋亡與Curcumin誘導的細胞死亡有關聯(lián)。3.Curcumin誘導卵巢癌細胞SK-OV-3和A2780細胞產(chǎn)生自噬現(xiàn)象的機制電鏡觀察卵巢癌A2780細胞的超微結構,15 μ M的Curcumin處理48h后的卵巢癌A2780細胞,結果表明用Curcumin處理的A2780細胞組與對照A2780細胞組相比存在大量自噬泡。SK-OV-3細胞的免疫熒光染色證實,自噬特異標記物LC3B在Curcumin作用下增加其熒光表達。與對照組相比,40μ MCurcumin作用SK-OV-3細胞48h顯示出LC3B熒光形成密度和強度的顯著增加,表明Curcumin可誘導SK-OV-3細胞發(fā)生自噬。差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。Western blot評估SK-OV-3和A2780自噬相關蛋白的表達。不同濃度Curcum in作用48h后,提取蛋白利用We stern blot檢測自噬相關靶點分子LC3B、Atg3、Beclin-1、P62蛋白表達,與對照組相比,Curcumin處理后的LC3B-II表達顯著增加(差異有統(tǒng)計學意義,P0.05),明顯上調Atg3、Beclin-1表達,明顯下調P62表達,且均以劑量依賴性表現(xiàn),表明Curcumin可以誘導卵巢癌細胞SK-OV-3和A2780產(chǎn)生自噬現(xiàn)象。4.自噬抑制劑加強Curcumin治療卵巢癌細胞SK-OV--3和A2 780的敏感性使用自噬抑制劑探討Curcumin誘導的自噬在SK-OV-3和A2780中發(fā)揮的作用。選用自噬抑制劑中的CQ,通過MTT檢測發(fā)現(xiàn)與單獨應用Curcumin相比,聯(lián)合應用CQ和Curcumin后,明顯降低SK-OV-3和A2780的細胞活力,說明CQ可增強Curcumin誘導的細胞死亡。凋亡檢測也證實CQ和Curcumin聯(lián)合組的凋亡率明顯高于獨立使用的Curcumin組。采用Ed U細胞增殖檢測法,驗證Cur c um i n和CQ聯(lián)合是否對細胞增殖有直接影響,結果顯示:與獨立使用Curcumin相比,CQ和Curcumin聯(lián)合顯著抑制SK-OV-3的EdU攝取率,說明自噬抑制劑CQ阻斷自噬的同時增加了Cur cumin誘導的細胞凋亡能力,與Cur cumin藥物聯(lián)合應用發(fā)揮抗卵巢癌作用。差異是否有統(tǒng)計學意義(P0.05)。5.LC3B在Curcumin誘導的卵巢癌細胞SK-OV-3和A2780自噬中的作用構建了shRNA穩(wěn)定敲減LC3B的SK-OV-3和A2780卵巢癌細胞系。Western blot顯示,在穩(wěn)定敲減LC3B的SK-OV-3和A2780細胞系中,相對于NC對照組(無目的基因病毒處理組),Curcumin處理后的LC3B-Ⅱ蛋白顯著表達升高,(差異有統(tǒng)計學意義,P0.05)。另外,LC3B shRNA對Curcumi n介導SK-OV-3和A2780發(fā)生細胞凋亡的影響中發(fā)現(xiàn)cleaved Caspase-9和cleaved PARP的蛋白表達上調,說明Curcumin處理后的LC3B穩(wěn)定敲除的SK-OV-3和A2780凋亡率明顯高于Curcumin處理的NC對照SK-OV-3和A2780細胞系,也就是說,敲減LC3B增強了Curcumin治療EOC細胞SK-OV-3和A2780的敏感性。6.Curcumin在卵巢癌細胞SK-OV-3和A2780中發(fā)生保護性自噬的機制研究采用不同濃度Curcumin(0、10、20、40OμM用于SK-OV-3卵巢癌細胞系,而0、7.5、15、30μM用于A2780卵巢癌細胞系)對SK-OV-3細胞和A2780細胞作用處理48h后,提取蛋白并檢測AKT/mTOR/p70S6K信號通路中相關分子的蛋白表達,結果顯示:與對照組相比,p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K、p-4E-BP1的蛋白表達量顯著下調,以濃度依賴性表現(xiàn)(差異有統(tǒng)計學意義,P0.05),而t-AKT、t-mTOR的蛋白表達無明顯差別,結果證實Curcumin是通過抑制AKT/mTOR/p70S6K通路誘導EOC細胞SK-OV-3和A2780自噬發(fā)揮保護作用。瞬時轉染AKT過表達質粒入SK-OV-3中,構建AKT過表達SK-OV-3細胞。Western blot顯示,過表達AKT的SK-OV-3卵巢癌細胞加Curcumin處理48h后提取總蛋白,LC3B-II的表達下調,并且逆轉了Curcumin誘導的細胞死亡。差異有統(tǒng)計學意義,P0.05。PI3K抑制劑LY294002預處理細胞,抑制AKT表達,Curcumin處理SK-OV-3和A2780細胞48h后提取總蛋白,LC3B-II表達上調,導致Curcumin誘導的細胞死亡。結果表明,下調AKT顯著促進Curcumin誘導的SK-OV-3和A2780細胞死亡和自噬。差異有統(tǒng)計學意義,P0.05。研究結論:1.Curcumin誘導EOC細胞凋亡機制,殺傷EOC細胞而抑制EOC;2.Curcumin抑制AKT/mTOR/p70S6K通路,誘導卵巢癌細胞產(chǎn)生保護性自噬而發(fā)生治療EOC的耐藥;3.自噬抑制劑CQ可增敏Curcumin的抗EOC細胞作用。創(chuàng)新性及意義:1.首次發(fā)現(xiàn)了 Curcumin聯(lián)合自噬抑制劑發(fā)揮協(xié)同抗卵巢癌效應;2.提出了自噬抑制劑可通過抑制Curcumin誘導的保護性自噬來增強Curcumin抗卵巢癌效應;3.解決EOC細胞凋亡抵抗和EOC化療耐藥提供了新的方向。局限性:1.未進行動物和臨床實驗,探討Curcumin對卵巢癌的治療作用;2.未能對Curcumin作用的主要靶點分子進行探究。
【圖文】：

圖２：邋Ｃｕｒｃｕｍｉｎ對ＳＫ－ＯＶ－３和Ａ２７８０細胞凋亡的影響逡逑（Ａ）．采用Ａｎｎｅｘｉｎ邋Ｖ邋（Ｘ軸）－ＰＩ邋（Ｙ軸）－流式細胞實驗定量分析ＳＫ－ＯＶ－３逡逑和Ａ２７８０細胞經(jīng)濃度梯度的Ｃｕｒｃｕｍｉｎ處理后細胞凋亡。左：流式細胞逡逑凋亡圖，，右：ＳＫ－０Ｖ－３和Ａ２７８０細胞凋亡率逡逑

Ｃｕｒ（ｐＭ）邋０邐１０邐２０邐４０邐０邐７．５邐１５邐３０逡逑圖３：邋Ｃｕｒｃｕｍｉｎ誘導卵巢癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３和Ａ２７８０發(fā)生自噬逡逑的機制逡逑（Ａ）．電鏡觀察Ａ２７８０細胞經(jīng)Ｃｕｒｃｕｍｉｎ處理４８ｈ及其對照組。黑色箭頭逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R737.31

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