【摘要】：背景和目的孕期維生素D(Vitamin D,VD)缺乏普遍流行。盡管一些人群研究表明,妊娠期VD缺乏與后代肺部發(fā)育不良有關,但維生素D在肺部發(fā)育中的作用機制尚未闡明。本研究的主要目的是建立孕期VD缺乏誘發(fā)胎鼠肺發(fā)育不成熟的動物模型,并探討維生素D在胎鼠肺發(fā)育過程中的作用。方法購買8周大的ICR雌鼠,按照體重隨機分成對照組(Control)和維生素D缺乏組(VDD),兩組分別予以標準飼料和VD缺乏飼料喂養(yǎng)4周。小鼠體重大于28g后然后進行交配,把查到陰栓當天記為GD 0天。于GD 18天,留取母血,記錄死胎數、吸收胎和著床點,稱量胎鼠體重和肺臟重量。檢測血清中25(OH)D水平,構建VD缺乏動物模型。我們將胎肺制成切片,進行HE染色,對胎肺組織學進行評估,利用肺泡隔厚度和囊腔面積對胎肺進行定量分析;另一方面,利用免疫組織化學染色和糖原染色(PAS)的方法,分別檢測肺組織增殖狀況(Ki67陽性細胞數)和肺泡Ⅱ型細胞的分化程度(PAS陽性細胞數)。通過RTPCR和免疫印跡的方法,檢測胎肺組織表面活性相關蛋白水平和m RNA水平。結果結果顯示,VDD飲食缺乏組的小鼠的總25(OH)D水平顯著低于標準飲食組,因此成功建立孕期維生素D缺乏的動物模型。此外,VDD組孕鼠著床點數相較于Control組孕鼠顯著降低,而每窩死胎數相較于Control組則顯著升高。但是,VDD組和Control組在仔鼠流產數以及吸收數上并無明顯差異。進一步分析發(fā)現,孕期VD缺乏降低胎鼠的出生體重(Body weight,Bw)和胎肺絕對重量(Lung weight,Lw),Control組的明顯高于VDD組。Control組胎鼠的Lw/Bw顯著高于VDD組。組織學分析發(fā)現,對照組胎肺的囊腔面積顯著高于VDD組,而肺泡隔厚度小于VDD組。免疫組化結果顯示VDD組增殖程度明顯強于對照組;另一方面,對照組PAS陽性細胞數相對較少,提示了VDD組胎鼠肺泡Ⅱ型細胞分化異常。我們檢測兩組胎肺組織Sftpa,Sftpb,Sftpc和Sftpd的m RNA水平,其中VDD組上述基因m RNA水平均是顯著降低,而且pro-SPB蛋白水平也是降低的;免疫組化結果反映,和Control組相比,VDD組的pro-SPB陽性細胞數也是相對較少的。在VDD組胎肺組織中,Foxa1,Foxa2和TTF-1的表達均顯著下調。血管內皮生長因子a(Vegfa),在VDD組胎肺中也是顯著下調的。結論孕期VD缺乏導致胎鼠肺臟重量下降,并引起肺組織結構發(fā)育不成熟;VD缺乏引起肺泡Ⅱ型細胞分化異常,以及肺表面活性蛋白表達及其合成降低,進而引起胎肺發(fā)育不成熟。
【圖文】：

Implantation points per litter (n) 13.8±0.7 12.3±1.3*Resorptions per litter (n) 0.2±0.2 0.3±0.2Dead fetuses per litter (n) 0 0.42±0.2*Tab 5. Gestational vitamin D and pregnant outcomes. (N=12,Mean±SEM)*P < 0.05,**P <0.01 as compared with Control group3.2 孕期維生素 D 缺乏降低胎鼠肺臟重量進一步分析發(fā)現，孕期 VD 缺乏降低了胎鼠的出生體重（Bodyweight,Bw）（P< 0.05，見圖 2A）。在分離出胎鼠肺臟并稱重后發(fā)現，Control 組的胎肺絕對重量(Lung weight,Lw)明顯高于 VDD 組（P < 0.05，見圖 2B）。Control 組胎鼠的 Lw/Bw顯著高于 VDD 組（P < 0.05，，見圖 2C）。

Fig 2 Gestational vitamin D deficiency reduces fetal lung weight in mice. (A) Fetalbody weight; (B) Absolute wet lung weight; (C) Lung weight to body weight ratio(Lw/Bw). All data were expressed as Mean±SEM. (N=12). *P <0.05.3.3 妊娠期維生素 D 缺乏導致胎鼠肺部形態(tài)異常我們分析了孕期 VD 缺乏對胎鼠肺發(fā)育的影響。在光學顯微鏡下（放大倍數200 倍和 400 倍）觀察胎肺 HE 切片，結果顯示，利用 VDD 飲食的母鼠子代中，觀察到胎鼠肺部發(fā)育不成熟（如圖 3A 所示）。進一步地定量分析結果表明，VDD缺乏飲食組的子代肺部囊腔面積顯著低于正常飲食組，其中 VDD 缺乏飲食組比對照組降低約 20%，而其肺泡隔厚度則顯著高于正常飲食組，其中 VDD 組比正常飲食組厚度增加 12μm（如圖 3B 和 3C 所示）。上述肺 HE 染色結果提示，VDD飲食的母鼠其子代肺發(fā)育不成熟，可能導致肺不張。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R714

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本文編號：2588592