本文關(guān)鍵詞：卵巢特異性啟動子OSP-2在體內(nèi)體外對卵巢及卵巢癌示蹤的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:應(yīng)用OSP-2調(diào)控綠色熒光蛋白(GFP)特異性地在卵巢癌細胞表達,并結(jié)合活體生物熒光成像技術(shù)在裸鼠模型上對人卵巢癌細胞進行示蹤,為臨床卵巢癌的早期診斷和監(jiān)測復(fù)發(fā)提供新的思路,為下一步基因靶向治療提供實驗依據(jù)。方法:1.構(gòu)建由卵巢特異性啟動子調(diào)控的帶GFP基因的重組腺病毒載體;腺病毒轉(zhuǎn)染卵巢癌、卵巢細胞及其他正常細胞株,通過熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染效率,實時熒光定量PCR檢測OSP基因及GFP基因的表達效果;2.建立卵巢癌轉(zhuǎn)移裸鼠動物模型;在人卵巢癌轉(zhuǎn)移裸鼠動物模型中注入上述OSP啟動的重組腺病毒載體,采用CMV腺病毒載體作為陽性對照組和NS作陰性對照,運用活體生物熒光技術(shù)對體內(nèi)的人卵巢癌細胞進行顯像;3.對人卵巢癌轉(zhuǎn)移裸鼠動物模型中癌灶和各臟器、組織進行冰凍切片顯微觀察熒光、免疫組織化學(xué)觀察GFP陽性表達及熒光定量PCR對GFP基因相對表達量的檢測。結(jié)果:1.顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況:轉(zhuǎn)染96h后,顯微鏡觀察,卵巢癌細胞和卵巢細胞內(nèi)可見綠色熒光表達,但細胞株間轉(zhuǎn)染率有差異,其中卵巢癌(SKOV3細胞株)㧐倉鼠卵巢(CHO細胞株)㧐卵巢癌(OVCAR-3細胞株);正常細胞內(nèi)(肝細胞LO-2、臍靜脈上皮融合細胞EA.hy926及胃粘膜上皮細胞GES-1)均未見綠色熒光;2.細胞熒光定量PCR結(jié)果顯示:胃粘膜上皮細胞和肝細胞中OSP-2的表達水平轉(zhuǎn)染前后有差異(P0.05),與卵巢癌細胞株對比轉(zhuǎn)染后GFP表達量顯示對比有差異(P0.05),且正常細胞內(nèi)的GFP擴增無效;3.裸鼠活體熒光成像結(jié)果示:OSP注射組和CMV注射組均未見明顯熒光聚集區(qū),處死后行組織熒光成像示:CMV注射組中肝臟和胃可見熒光光團集聚,OSP注射組僅卵巢癌瘤體可見熒光集聚;4.組織冰凍切片顯微鏡下觀察熒光顯示:CMV注射組各臟器組織均可見熒光,其中肝臟的熒光最強,OSP注射組僅瘤體及卵巢可見微弱熒光,NS注射組均未見熒光;5.組織GFP免疫組化顯示:CMV注射組中肝臟、肺組織、胃組織、腸道、瘤體均可見GFP表達,其中肝臟表達最強;OSP注射組僅瘤體可見GFP表達;6.組織熒光定量PCR顯示:CMV注射組與OSP注射組對比GFP有差異(P0.05),OSP注射組與NS組對比GFP表達顯示組織有自發(fā)熒光,結(jié)果存在誤差。結(jié)論:通過體外實驗得出OSP-2僅在卵巢癌細胞和卵巢細胞內(nèi)特異性啟動目的基因GFP的表達,進一步的體內(nèi)驗證也證實了OSP-2的卵巢組織特異性啟動功能,為下一步的卵巢癌分子生物診斷和靶向治療提供了一定的前期基礎(chǔ)。但是在實驗過程中發(fā)現(xiàn),OSP-2啟動功能不能達到預(yù)期的理想,后期實驗中課題組重組腺病毒載體時可以多個OSP-2重組或者和CMV啟動子合用增強啟動功能。
【關(guān)鍵詞】：卵巢特異性啟動子 活體熒光表達 功能驗證
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-11
• 第1章 引言11-14
• 第2章 材料與方法14-27
• 2.1 實驗材料14
• 2.1.1 細胞來源14
• 2.1.2 動物來源14
• 2.1.3 病毒來源14
• 2.2 主要儀器和試劑14-17
• 2.2.1 主要儀器14-15
• 2.2.2 主要試劑15-16
• 2.2.3 試劑配置16-17
• 2.3 實驗方法17-26
• 2.3.1 細胞培養(yǎng)17-19
• 2.3.2 細胞轉(zhuǎn)染19-20
• 2.3.3 細胞/組織的總RNA提取、純化及RNA純度與濃度檢測20-23
• 2.3.4 裸鼠體內(nèi)實驗23-25
• 2.3.5 冰凍切片熒光檢測25
• 2.3.6 組織免疫組化25-26
• 2.4 統(tǒng)計分析26-27
• 第3章 結(jié)果27-46
• 3.1 細胞轉(zhuǎn)染結(jié)果27
• 3.2 RNA質(zhì)量控制27-28
• 3.2.1 大體觀察結(jié)果27-28
• 3.2.2 紫外分光光度計掃描結(jié)果28
• 3.3 裸鼠實驗結(jié)果28-38
• 3.3.1 成瘤28-29
• 3.3.2 活體熒光成像29-32
• 3.3.3 冰凍組織切片熒光32-35
• 3.3.4 免疫組化35-38
• 3.4 PCR結(jié)果38-46
• 3.4.1 細胞PCR結(jié)果38-41
• 3.4.2 組織PCR結(jié)果41-46
• 第4章 討論46-52
• 4.1 卵巢癌的診斷和治療46-47
• 4.2 組織特異性啟動子47-48
• 4.3 OSP--卵巢特異性啟動子48-49
• 4.4 體內(nèi)外驗證特異性啟動子49-50
• 4.5 實驗不足之處50-52
• 第5章 結(jié)論52-53
• 致謝53-54
• 參考文獻54-58
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果58-59
• 綜述59-66
• 參考文獻64-66

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本文編號：257630