【摘要】：目的觀察雷帕霉素誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細胞自噬后miR-18a、miR-19a、miR-21及miR-144表達的變化,并以miR-144為研究對象,驗證其對自噬相關(guān)基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(mTOR)的靶向調(diào)控作用。方法分別用50 ng/m L雷帕霉素(雷帕霉素組)及10 nmol/L 3-甲基腺嘌呤(3-MA組)作用于SKOV3細胞2、12 h,收集細胞,并設(shè)立不進行任何處理的細胞作為對照組,提取總RNA;應(yīng)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測4種miRNAs的表達水平。培養(yǎng)SKOV3細胞,設(shè)立正常細胞組、miR-144 mimic組和miR-144 inhibitor組,分別將合成的miR-144mimic及miR-144 inhibitor轉(zhuǎn)染到SKOV3細胞內(nèi),正常細胞組不處理。應(yīng)用qRT-PCR方法檢測各組的miR-144及mTOR mRNA表達量,應(yīng)用Western blotting法檢測各組細胞中mTOR蛋白表達量。應(yīng)用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-144與mTOR的相互作用關(guān)系。結(jié)果對照組細胞miR-18a、miR-19a、miR-21及miR-144的表達量分別為1.003±0.021、1.001±0.039、1.014±0.016、1.028±0.037;雷帕霉素組4種miRNAs的表達量分別為6.310±0.025、1.200±0.058、52.310±0.005、63.490±0.024,其miR-18a、miR-21及miR-144高于對照組(P均0.05);3-MA組SKOV-3細胞的4種miRNAs的表達量分別為0.540±0.019、0.890±0.062、0.820±0.012和0.660±0.003,其miR-18a及miR-144低于對照組(P均0.05)。與正常細胞組比較,miR-144 mimic組miR-144 mRNA表達量高(P0.05),mTOR mRNA和蛋白的表達量降低(P均0.05);miR-144 inhibitor組miR-144表達量下降(P0.05),mTOR mRNA和蛋白的表達量升高(P均0.05)。miR-144 mimic分別與mTOR-WT及mTOR-Mut共轉(zhuǎn)染,前者的熒光表達量低于后者(P均0.05)。結(jié)論 SKOV3細胞發(fā)生自噬后,miR-18a、miR-21及miR-144表達升高,miR-144可靶向抑制mTOR的表達。

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