【摘要】：研究背景 卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤。目前研究認(rèn)為腫瘤異質(zhì)性是導(dǎo)致患者腫瘤耐藥,治療失敗的主要原因。腫瘤在不斷發(fā)生著異質(zhì)性變化,用不變的治療模式去治療不斷變化的腫瘤,顯然不能達(dá)到徹底治愈的效果。卵巢癌也是一種異質(zhì)性疾病,每一個(gè)卵巢腫瘤都可以被看成是許多遺傳和表觀遺傳性狀各異的細(xì)胞的集合。了解卵巢不同異質(zhì)性亞群與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后相關(guān)的分子表型和基因圖譜特征,制定出有針對(duì)性的個(gè)體化治療方案,對(duì)腫瘤的長(zhǎng)期控制產(chǎn)生極其重要的促進(jìn)意義。 研究目的 1從人卵巢漿乳癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和SKOV3中分別分離和篩選出具有不同侵襲、遷移能力的單細(xì)胞亞群； 2對(duì)篩選出的高、低侵襲單細(xì)胞亞群進(jìn)一步進(jìn)行轉(zhuǎn)移相關(guān)表型特征的檢測(cè)和驗(yàn)證,以明確其能否作為卵巢癌異質(zhì)性相關(guān)機(jī)制研究的細(xì)胞模型模型； 3對(duì)2組高、低侵襲單細(xì)胞亞群,進(jìn)行全基因組外顯子測(cè)序(Exome Seq)分析和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNASeq),篩選出可能與卵巢癌不同侵襲能力等腫瘤異質(zhì)性產(chǎn)生相關(guān)的候選基因,為下一步的臨床驗(yàn)證打下基礎(chǔ)。 研究方法 1通過(guò)有限稀釋法,對(duì)2個(gè)卵巢漿乳癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、SKOV3進(jìn)行單細(xì)胞分選和克隆化培養(yǎng)。Transwell小室體外侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)+MTT法對(duì)分選出的單細(xì)胞亞群的侵襲、遷移能力進(jìn)行初步的鑒定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出侵襲能力最強(qiáng)和最弱,并且性狀相對(duì)穩(wěn)定的單細(xì)胞亞群。 2利用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)比較高、低侵襲單細(xì)胞亞群細(xì)胞增殖能力的差異；PI和Annexin V雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)、比較二者的細(xì)胞凋亡率,然后通過(guò)RealTime PCR和Western Blot檢測(cè)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Caspase3及Caspase7mRNA和蛋白水平,比較高、低侵襲單細(xì)胞亞群抗凋亡能力的差異；通過(guò)檢測(cè)抗失巢凋亡蛋白TrkB和自噬活性相關(guān)蛋白Beclin1mRNA和蛋白表達(dá)水平,比較二者的抗失巢凋亡能力和自噬活性的差異；MTT法檢測(cè)二者對(duì)紫杉醇和順鉑的藥物敏感性；裸鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞,比較二者成瘤能力的差異； 3利用G顯帶技術(shù)對(duì)高、低侵襲亞群進(jìn)行染色體核型分析,比較二者在染色體水平的異質(zhì)性,并對(duì)各個(gè)單細(xì)胞亞群內(nèi)部的均質(zhì)性進(jìn)行評(píng)價(jià)；對(duì)高、低侵襲單細(xì)胞亞群進(jìn)行Exome Seq和RNA Seq。比較高、低侵襲亞群基因圖譜的差異,篩選出可能與卵巢癌不同侵襲能力等腫瘤異質(zhì)性產(chǎn)生相關(guān)的候選基因,為將來(lái)的臨床驗(yàn)證打下基礎(chǔ)。 研究結(jié)果 1.通過(guò)有限稀釋法,在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)條件下,分別從卵巢漿乳癌細(xì)胞系A(chǔ)2780及SKOV3經(jīng)單細(xì)胞分離和克隆化培養(yǎng),得到45個(gè)和40個(gè)單細(xì)胞亞群。經(jīng)外侵襲、遷移能力實(shí)驗(yàn)的鑒定、篩選,得到侵襲、遷移能力差異最大,且性狀相對(duì)穩(wěn)定的單細(xì)胞亞群,分別命名為A-H, S-H,以及A-L, S-L。篩選出的單細(xì)胞亞群經(jīng)連續(xù)傳代至30代左右,性狀仍保持相對(duì)穩(wěn)定。 2.A-H和A-L,S-H和S-L,不但在體外侵襲、遷移能力方面,在細(xì)胞增殖、抗凋亡及失巢凋亡、自噬活性、抗藥性,以及裸鼠異體移植成瘤能力等多個(gè)轉(zhuǎn)移相關(guān)的表型特征方面,均具有顯著的異質(zhì)性,高侵襲單細(xì)胞亞群表現(xiàn)出更強(qiáng)的獨(dú)立存活能力。 3.A-H和A-L, S-H和S-L,在染色體水平上也具有明顯的異質(zhì)性,而4個(gè)單細(xì)胞亞群內(nèi)部則表現(xiàn)出良好的均質(zhì)性。Exome Seq數(shù)據(jù)經(jīng)逐步篩選和過(guò)濾,最終在2組高、低侵襲亞群之間獲得共同差異基因變異位點(diǎn)共計(jì)66個(gè)(包括Indel：57個(gè),SNP：9個(gè))。在其中隨機(jī)選擇10個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了Sanger測(cè)序驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)CNTNAP1在2個(gè)高侵襲單細(xì)胞亞群存在5’-UTR區(qū)的突變,而在2個(gè)低侵襲亞群則為陰性。RNA Seq,按照P0.05, Fold change2的標(biāo)準(zhǔn),在2組高、低侵襲單細(xì)胞亞群之間篩選到差異基因25個(gè)(包括20個(gè)基因在A-H及S-H轉(zhuǎn)錄本中同時(shí)上調(diào),5個(gè)在A-L及S-L中同時(shí)上調(diào))。選擇部分候選基因經(jīng)Real Time PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路中,PIK3CA、PIK3CA、AKT3、ECM1、GPCR等基因的mRtNA在A-H及S-H中均顯著增高,腫瘤抑制基因Nur77,PTEN顯著降低。MTOR通路中,mTOR及PRKCB基因的mRNA在A-H、S-H中亦顯著增高。結(jié)果與RNA Seq結(jié)果一致。Western Blot結(jié)果在蛋白水平再次說(shuō)明了RNA Seq結(jié)果可信。 研究結(jié)論 1人卵巢漿乳癌細(xì)胞系中存在著具有不同侵襲能力的異質(zhì)性細(xì)胞亞群。 2A-H/S-H與A-L/S-L是較為理想的研究卵巢癌腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的細(xì)胞模型。 3高侵襲細(xì)胞亞群具有更強(qiáng)的獨(dú)立存活能力,可能在腫瘤的浸潤(rùn),轉(zhuǎn)移和耐藥過(guò)程中發(fā)揮著更主要的作用。 4CNTNAP1基因突變,PI3K/AKT/mTOR信號(hào)傳導(dǎo)通路激活及其相關(guān)基因的異常表達(dá)可能與卵巢癌不同侵襲能力等腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的產(chǎn)生相關(guān)。但有關(guān)其作用機(jī)制和臨床意義有待進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 韓亞玲;馮彥斌;羅曼莉;徐昕;蔡巖;王明榮;;人食管癌EC9706單克隆的分離培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究[J];遺傳;2007年11期

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本文編號(hào)：2550834