【摘要】：目前卵巢癌患者發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化，發(fā)病率逐年升高，在婦科惡性腫瘤中僅次宮頸癌，死亡率卻居于榜首。卵巢癌目前臨床上公認(rèn)的治療方案是：滿意的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)+鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，但患者病情好轉(zhuǎn)后復(fù)發(fā)的比例高達(dá)70%-80%。大量臨床工作者總結(jié)發(fā)現(xiàn)卵巢癌易發(fā)生癌灶轉(zhuǎn)移，手術(shù)常常不能完全切除，且易對化療藥物產(chǎn)生耐藥（尤其以對鉑類的耐藥多見）。故復(fù)發(fā)性卵巢癌的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移和化療耐藥始終是治療的兩大難點(diǎn)，是影響患者預(yù)后最主要的因素。難治性復(fù)發(fā)性卵巢癌患者目前的治療方案主要有：手術(shù)、放療、化療、免疫治療以及內(nèi)分泌治療等，其中內(nèi)分泌治療是目前研究的熱點(diǎn)之一，而在內(nèi)分泌治療中又以促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing-hormone，GnRH）類似物的運(yùn)用研究最為廣泛。人工合成的GnRH類似物是天然GnRH生物學(xué)效應(yīng)的50-100倍，可以競爭性與垂體的GnRH受體結(jié)合，抑制LH、FSH的分泌，引起促性腺功能的抑制效應(yīng)，80%的GnRH類似物與GnRH-Ⅰ受體結(jié)合。卵巢癌是一種性激素依賴性腫瘤，約80%的人類卵巢上皮性癌組織中有GnRH-Ⅰ受體的表達(dá)。腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成是影響腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要方面。基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）是鋅離子依賴的蛋白水解酶，可有效降解細(xì)胞外基質(zhì)，被認(rèn)為在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用；組織金屬蛋白酶抑制劑（Tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）能特異性地與MMPs的結(jié)合，降低MMPs的活性，兩者的失衡作為研究細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的最重要的方向。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知活性最強(qiáng)、專屬性最高的血管生成因子，常被當(dāng)做血管生成的最重要的研究分子。表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）是腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的一個重要因子，大量研究證實EGFR可誘導(dǎo)MMPs活性增強(qiáng)，TIMPs活性降低，兩者平衡失調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。且EGFR與血管生成密切相關(guān)，可以通過促進(jìn)VEGF的高表達(dá)，來誘導(dǎo)腫瘤的血管生成。GnRH類似物可以與卵巢癌細(xì)胞表面的GnRH-1型受體結(jié)合，下調(diào)EGFR的活性。課題組的前期實驗證實，伴隨鉑類耐藥卵巢癌（OVCAR-3/CDDP）細(xì)胞耐藥性越高，EGFR表達(dá)也越高，侵襲侵襲轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)；GnRH類似物可下調(diào)OVCAR-3/CDDP細(xì)胞EGFR的表達(dá)。那么是否可以通過GnRH類似物下調(diào)耐藥卵巢癌細(xì)胞EGFR的表達(dá)，來抑制其侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成？本實驗將研究GnRH類似物與順鉑兩藥聯(lián)合對鉑類耐藥卵巢細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成的作用，并對其相關(guān)可能的機(jī)制進(jìn)行探索。目的：觀察GnRH類似物—曲普瑞林（Triptorelin）聯(lián)合順鉑對鉑類耐藥人卵巢癌細(xì)胞（OVCAR-3/CDDP）侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成的作用，并對其可能的分子機(jī)制進(jìn)行研究。 方法：前期采用CDDP濃度逐步遞增、間歇作用的方法體外誘導(dǎo)卵巢癌（OVCAR-3）細(xì)胞耐藥性，目前達(dá)到中度耐藥。實驗按照不同的處理方法分為：(1)生理鹽水對照組：(2)順鉑組；(3)曲普瑞林處理組；(4)曲普瑞林聯(lián)合順鉑組處理組。采用Real-time法檢測不同藥物處理組對鉑類耐藥卵巢癌OVCAR-3/CDDP細(xì)胞EGFR,VEGF,MMP-2,MMP-9,TIMP-1,TIMP-2的mRNA相對表達(dá)量的影響;Western blot蛋白免疫印記法檢測VEGF蛋白表達(dá)的變化；劃痕實驗和Transwell小室侵襲實驗比較耐藥卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力變化；雞胚尿囊膜實驗檢測對鉑類耐藥卵巢細(xì)胞荷瘤組織的血管生成的影響。 結(jié)果:（1）與對照組和單藥處理組相比，曲普瑞林和順鉑兩藥聯(lián)合使OVCAR-3/CDDP細(xì)胞的EGFRmRNA的表達(dá)降低，同時下調(diào)VEGF,MMP-2，MMP-9的mRNA表達(dá)，TIMP-1和TIMP-2的mRNA表達(dá)量上升，，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)曲普瑞林和順鉑處理組與對照組相比，OVCAR-3/CDDP細(xì)胞的VEGF蛋白表達(dá)減少，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；兩藥聯(lián)合組與對照組及單藥處理組相比，VEGF蛋白的表達(dá)降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3)劃痕實驗中各不同藥物處理組與對照組相比，劃痕愈合率均降低，且Transwell小室穿膜細(xì)胞數(shù)也降低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；且與單藥處理組相比，兩藥聯(lián)合處理組表達(dá)更低，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。(4)雞胚尿囊膜實驗結(jié)果：曲普瑞林和順鉑單獨(dú)用藥均能抑制耐藥荷瘤組織的血管形成，抑制率分別為20.76%和16.66%；兩藥聯(lián)合作用后抑制作用更顯著，抑制率達(dá)36.50%。 結(jié)論：在耐藥卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-3/CDDP中，曲普瑞林和順鉑可抑制耐藥卵巢癌的的侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成，且兩藥聯(lián)合運(yùn)用抑制效果較單藥更為顯著。GnRH類似物對于出現(xiàn)鉑類耐藥的復(fù)發(fā)性卵巢的臨床治療可能具有很大的潛力。
【圖文】：

圖 1：各不同處理對 EGFR mRNA 表達(dá)水平的影響注：A 為對照組，B 曲普瑞林處理組，C 兩藥聯(lián)合組，D 順鉑組*：與對照組相比，P<0.05；#與兩藥聯(lián)合相比，P<0.05細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)因子 MMP-2/TIMP-2，M達(dá)檢測

圖2：各組細(xì)胞劃痕試驗細(xì)胞遷移能力變化。 圖3:各組細(xì)胞劃痕愈合率的變化人工傷痕(Oh)和愈合情觀(48h)比較注：A 為對照組，B 曲普瑞林處理組，C 兩藥聯(lián)合組，D 順鉑組*：與對照組相比，P<0.05；#與兩藥聯(lián)合相比，P<0.05。4、耐藥卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的檢測OVCAR-3/CDDP 加入鋪有 Matrigel 膠的 Transwell 小室，上室加入含有各組藥物的無血清培養(yǎng)基，下室加入含血清培養(yǎng)基，24 小時后，擦去膜表面的細(xì)胞及 Matrige膠，固定染色后拍照（圖 4），計算膜細(xì)胞數(shù)（圖 5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩藥聯(lián)合能夠抑
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2550785