【摘要】：研究目的全球每年約有一千五百萬早產(chǎn)兒誕生,早產(chǎn)兒是新生兒死亡的主要原因,并且存活下來的早產(chǎn)兒也面臨腦組織損傷等遠期問題。因此,如何預(yù)防早產(chǎn)及保護圍生兒腦組織免于損傷成為現(xiàn)代圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)一個非常重要的研究課題。越來越多的臨床證據(jù)表明宮內(nèi)感染所致絨毛膜羊膜炎(chorioamnionitis, CAM)是導(dǎo)致早產(chǎn)的高危因素,是子代腦組織損傷及遠期不良神經(jīng)系統(tǒng)預(yù)后的重要原因。然而,絨毛膜羊膜炎發(fā)病隱匿,多數(shù)無明顯臨床癥狀,主要依賴產(chǎn)后胎盤的組織學(xué)診斷,往往診斷和治療滯后,難以研究其致病機制及給予早期干預(yù)和治療。因此,我們前期采用了國際上最常使用的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)法建立宮內(nèi)感染孕鼠模型,擬在此基礎(chǔ)之上研究宮內(nèi)感染與早產(chǎn)和子代腦組織損傷的關(guān)系,目的是為了尋找及優(yōu)化一種早期干預(yù)和治療措施,來改善宮內(nèi)感染孕鼠早產(chǎn)結(jié)局和預(yù)防其子代腦組織損傷。N-乙酰L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)具有抗炎、抗氧化作用及調(diào)節(jié)細胞凋亡等功能。激活的小膠質(zhì)細胞可產(chǎn)生多種炎癥因子,在新生兒腦損傷中起著重要的作用。它在激活后具有吞噬特性,能夠攝取納米顆粒。因此,人們設(shè)計了N-乙酰-L-半胱氨酸樹狀大分子(dendrimer-based N-acetyl-L-cysteine, DNAC)納米材料,并證實其能選擇性地被激活的小膠質(zhì)細胞攝取,具有靶向控制炎癥、保護腦組織免于損傷的作用。因此,我們設(shè)想在前期已建立宮內(nèi)感染孕鼠模型的基礎(chǔ)上,應(yīng)用DNAC對宮內(nèi)感染孕鼠進行干預(yù),目的是系統(tǒng)研究：1)宮內(nèi)感染對早產(chǎn)及子代神經(jīng)系統(tǒng)損傷的影響；2)DNAC納米材料對宮內(nèi)感染孕鼠模型早產(chǎn)結(jié)局的預(yù)防作用；3)DNAC納米材料對宮內(nèi)感染孕鼠模型子代腦組織損傷的保護作用；4)DNAC納米材料預(yù)防早產(chǎn)及改善子代腦組織損傷的相關(guān)機制。研究方法將購自Charles River實驗室的孕17天CD-1小鼠,分為非手術(shù)組及手術(shù)組,手術(shù)組分為生理鹽水組(normal saline, NS)和LPS組,行剖腹手術(shù)并于右側(cè)子宮角第一、二胚胎之間注射NS100ul或者25ugLPS(溶于100ulNS中)。術(shù)后1小時NS組和LPS組分別接受腹腔注射DNAC 150ul (10mg/kg)。1.術(shù)后24小時觀察早產(chǎn)情況并計算早產(chǎn)率；2.出生后5、9、13天小鼠進行神經(jīng)行為學(xué)評估；3.術(shù)后6小時,剖宮留取胎盤和胎鼠腦組織,觀察：(1)胎盤和胎鼠腦組織的凋亡基因caspase3的表達；(3)胎盤內(nèi)急性炎癥期STAT3和NFκB p65基因的表達、促炎因子的變化和免疫細胞CD3+T細胞的浸潤情況；(4)胎鼠腦皮質(zhì)和腦室區(qū)小膠質(zhì)細胞的激活狀況；4.出生17天的小鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞的激活狀況。結(jié)果1. DNAC可降低宮內(nèi)感染孕鼠模型的早產(chǎn)率。在同胎產(chǎn)仔數(shù)無明顯差異的情況下,LPS組(n=12)早產(chǎn)率最高,為83%。LPS+DNAC組(n=13)早產(chǎn)率為31%。LPS組與對照組相比,早產(chǎn)率明顯升高；應(yīng)用DNAC后,早產(chǎn)率明顯下降。(p值0.05)。表明：LPS所致宮內(nèi)感染可引起早產(chǎn)發(fā)生,DNAC治療可明顯降低宮內(nèi)感染所誘發(fā)的早產(chǎn)。2. DNAC可改善宮內(nèi)感染孕鼠子代神經(jīng)行為學(xué)的異常表現(xiàn)在出生后5、9、13天進行平面翻正、懸崖回避、負趨反射和小鼠移動實驗來評估其神經(jīng)行為學(xué)狀況。運動能力的評估通過平面運動、負趨實驗完成,認知能力的評估通過懸崖回避和小鼠移動實驗完成。結(jié)果顯示：出生后5天,沒有幼鼠能夠完成小鼠移動實驗,其它二組實驗中,LPS組幼鼠運動和認知行為明顯受損,LPS+DNAC組明顯改善。生后9天及第13天,所有實驗均顯示,LPS組受損,LPS+DNAC組明顯改善。(p值具有統(tǒng)計學(xué)意義)。表明：LPS所致的宮內(nèi)感染可影響子代腦神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育,DNAC治療可以減輕宮內(nèi)感染所致的子代腦神經(jīng)系統(tǒng)的損害。3. DNAC降低了胎鼠腦組織中活性Caspase3的表達。采用western blot檢測胎盤組織和胎鼠腦組織中caspase 3的表達。Image J分析蛋白印跡密度,計算cleaved caspase 3 (caspase 3的活性形式)和pro-caspase3的比值。結(jié)果顯示：胎盤組織中各組間caspase 3的活性沒有明顯改變；胎鼠腦組織中LPS組和NS組比較,caspase 3的活性明顯升高,LPS+DNAC組和LPS組比較,caspase 3的活性明顯降低(p值具有統(tǒng)計學(xué)意義)。表明：宮內(nèi)感染對于胎盤組織的凋亡無明顯影響,但是可促進子代腦組織細胞的凋亡；DNAC治療后,可顯著抑制子代腦細胞的凋亡,起到保護腦組織及功能的作用。4. DNAC抑制了胎盤急性炎癥期STST3活性狀態(tài)的表達和炎癥因子的分泌4.1 NFκB p65和STAT3在細胞急性炎癥反應(yīng)中具有重要作用,p65和STAT3都需要磷酸化后才能被激活。為了評估免疫活性功能,我們采用western blot檢測了胎盤組織中磷酸化STAT3(pSTAT3)及總STAT3,磷酸化p65(p-p65)和總p65。計算pSTAT3/STAT3和P-p65/p65的比值。結(jié)果顯示：P-p65/p65的比值在各組之間無明顯變化；pSTAT3/STAT3的比值,LPS組較NS組明顯升高,LPS+DNAC組較LPS組明顯降低。(p值具有統(tǒng)計學(xué)意義)4.2采用RT-qPCR檢測胎盤組織炎癥因子的基因表達,用18s核糖體RNA作對照。LPS組和NS組、非手術(shù)對照組相比,TNF-α、IL-1β、IL-10及IL-6明顯升高,LPS+DNAC組較LPS組相比,上述各炎癥因子明顯降低。(p值具有統(tǒng)計學(xué)意義)上述結(jié)果表明：LPS誘發(fā)了胎盤部位的急性炎癥反應(yīng)并促進了炎癥因子的表達,DNAC治療可以起到明顯抑制作用。5. DNAC降低了胎盤中CD3+T細胞的浸潤為研究宮內(nèi)感染及DNAC治療后母胎界面的免疫激活狀況,采用免疫組化方法,用抗-CD45抗體(血細胞的marker)和抗-CD3抗體(T細胞的marker)標(biāo)記,DAPI作為細胞核的標(biāo)記,觀察胎盤的母體面和子體面CD45+和CD3+的細胞數(shù)量(不包括血管區(qū))。結(jié)果顯示：在血管壁的周圍可觀察到CD3+/CD45+T細胞增多,此現(xiàn)象僅在LPS組觀察到,在其它三組未觀察到。無論是在胎盤的母體面還是子體面,LPS組較其它三組,CD3+細胞數(shù)及CD3+/CD45+細胞比值均增高。(p值具有統(tǒng)計學(xué)意義)。表明：DNAC抑制了外周免疫細胞于急性炎癥期向胎盤組織浸潤,其可能在免疫反應(yīng)的早期起到了保護胎盤屏障的作用。6. DNAC減輕了LPS所致的小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)小膠質(zhì)細胞是腦組織中特化的巨噬細胞,持續(xù)的小膠質(zhì)細胞的激活和腦白質(zhì)發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)的損傷有關(guān)。為了確定DNAC對小膠質(zhì)細胞激活的作用,我們用免疫組化方法,分析胎鼠腦皮質(zhì)和腦室區(qū)小膠質(zhì)細胞的激活狀況；用免疫組化和流式細胞檢測出生后17天的小鼠腦皮質(zhì)和海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞的激活狀況。免疫組化結(jié)果顯示,宮內(nèi)感染孕鼠子代腦組織中小膠質(zhì)細胞可由靜止?fàn)顟B(tài)的分枝狀變成激活狀態(tài)的阿米巴樣,DNAC治療抑制小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài)；流式細胞儀分析小膠質(zhì)細胞的激活狀態(tài),用抗-CD45抗體,抗-CD11b抗體及抗Iba-1抗體標(biāo)記,CD11b+/CD45int用于識別小膠質(zhì)細胞,Iba-1陽性表達用來識別小膠質(zhì)細胞的活性狀態(tài)。結(jié)果顯示：Iba-1+細胞數(shù),LPS暴露組的子代較NS組明顯升高,而DNAC治療組較LPS組明顯降低。(p值具有統(tǒng)計學(xué)意義)。表明：LPS誘導(dǎo)的宮內(nèi)感染可以長期持續(xù)影響子代小膠質(zhì)細胞的激活,導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的不良預(yù)后；應(yīng)用DNAC治療可以保護宮內(nèi)感染孕鼠子代腦組織免受損傷。結(jié)論及意義1. DNAC可能具有預(yù)防宮內(nèi)感染所致孕鼠早產(chǎn)的作用,并且可能具有保護其子代腦神經(jīng)發(fā)育的功能,為宮內(nèi)感染所致早產(chǎn)及子代腦損傷提供了一種早期預(yù)防和干預(yù)的措施。從而推測未來產(chǎn)前的靶向治療可能將給宮內(nèi)感染的母胎結(jié)局帶來較大影響。2. DNAC治療宮內(nèi)感染孕鼠模型的可能機制：(1)抑制胎盤部位的炎癥反應(yīng),改善母胎界面的微環(huán)境；(2)抑制子代小膠質(zhì)細胞的激活,減輕腦組織的炎癥反應(yīng)；(3)抑制胎鼠腦細胞的凋亡；(4)抑制外周免疫細胞于急性炎癥期向胎盤組織浸潤,推測DNAC在免疫反應(yīng)的早期起到了保護胎盤屏障的作用。對進一步闡明早產(chǎn)發(fā)生機制及拓展DNAC的臨床應(yīng)用范圍提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R714.7

【共引文獻】

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本文編號：2512989