【摘要】：目的:既往對胰島素的作用研究主要集中在代謝方面。臨床觀察發(fā)現(xiàn)在一些以高胰島素血癥或者胰島素抵抗為主要特征的疾病患者中,胚胎著床能力下降、著床后流產(chǎn)率高。母體子宮內膜功能的正常維持對于胚胎發(fā)育十分重要。已有研究顯示在高胰島素的直接作用下胚胎發(fā)育異常,但其對母體子宮內膜的調控作用尚未見研究報道。隨著子宮內膜容受性的建立,胚胎植入母體,緊接著母體子宮內膜發(fā)生蛻膜化,在胎盤形成以前擔負著營養(yǎng)胚胎的作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在高胰島素的作用下子宮內膜容受性受損、蛻膜化異常。子宮內膜蛻膜化過程中,一個重要的改變是血管生成與血管重塑。血管生成對子宮內膜的蛻膜化至關重要,它建立了一個復雜的血竇與血管網(wǎng)絡系統(tǒng),血管網(wǎng)絡作為母體和胚胎之間的物質交換裝置,對于正常妊娠的維持十分關鍵。研究表明高水平胰島素對其他組織和器官的血管生成具有十分重要的作用,因此我們推測,高水平胰島素可能也會參與調控子宮內膜蛻膜化血管生成。因此本研究旨在通過構建高水平胰島素的動物和細胞模型,探討高胰島素對早孕小鼠子宮內膜蛻膜化過程中血管生成的影響及其可能的機制。方法:1.模型的構建與材料收集(1)高胰島素小鼠模型構建:采用皮下注射胰島素的方法構建高胰島素小鼠模型。同時將高胰島素小鼠(IN)與對照小鼠(CON)分別用于構建正常妊娠模型和人工誘導蛻膜化模型(AI)。(2)正常妊娠模型:分別將對照組和高胰島素組雌鼠與正常成年雄鼠于下午18:00合籠(雌:雄,4:1),次日清晨檢查雌鼠陰道有無陰栓,有陰栓者確定為妊娠第1天(D1)。于妊娠第6、7和8天(D6、D7和D8)收集血清及子宮組織進行相關檢測,并檢測血糖。(3)人工誘導蛻膜化模型:分別將對照組和高胰島素組雌鼠與輸精管結扎的雄鼠下午18:00合籠,次日清晨檢查雌鼠陰道有無陰栓,有陰栓者確定為假孕第1天(PD1),在小鼠假孕第4天(PD4)早上9:00,將小鼠的一側子宮注射芝麻油25μl(誘導側),另一側子宮不進行注射作為對照。于假孕PD8早上9:00收取人工誘導蛻膜化誘導側子宮進行相關分析。2.子宮內膜蛻膜化標志分子的檢測:采用Real-time PCR、Western-blot方法檢測正常妊娠模型D6、D7、D8天孕鼠子宮內膜組織和人工誘導蛻膜化模型誘導側小鼠子宮內膜組織蛻膜化標志分子BMP2、PRL的表達,免疫組化的方法檢測正常妊娠小鼠孕D8天子宮內膜BMP2的表達。3.血管網(wǎng)絡與管腔生成能力檢測:免疫組化對正常妊娠小鼠模型D7、D8天孕鼠子宮和人工誘導蛻膜化模型小鼠誘導側子宮進行血管標志分子CD34染色。管腔成型實驗檢測高水平胰島素對人臍靜脈內皮細胞(HUVECS)管腔成型能力的影響。4.血管生成相關因子表達檢測:Real-time PCR檢測正常妊娠小鼠模型D6、D7、D8天孕鼠子宮內膜組織和人工誘導蛻膜化模型小鼠誘導側子宮內膜組織中VEGFA、VEGFR2、ANG-1、和TIE2的表達。Western-blot檢測正常妊娠小鼠模型D6、D7、D8天孕鼠子宮內膜組織和人工誘導蛻膜化模型小鼠誘導側子宮內膜組織中VEGFA、ANG-1、和TIE2的表達。免疫組化檢測孕鼠妊娠D7、D8天子宮內膜VEGFA、ANG-1的表達。高胰島素處理后Western-blot檢測HUVECS細胞中VEGFA、ANG-1、TIE2的蛋白表達,免疫熒光檢測HUVECS細胞中VEGFA表達。5.自噬相關檢測:Western-blot檢測正常妊娠小鼠模型孕D6、D7、D8天小鼠子宮內膜中自噬標志因子LC3、p62、Atg5、Beclin1、ULK1、p-ULK1的蛋白表達。免疫熒光檢測HUVECS在高水平胰島素作用下自噬標志分子LC3的表達改變。進一步運用自噬抑制劑3-MA抑制自噬后,管腔成型實驗檢測HUVECS的管腔成型能力,免疫熒光檢測HUVECS中VEGFA的表達。結果:1.ELISA結果顯示高胰島素組孕鼠血清胰島素水平相對于對照組顯著升高(p0.001),血糖水平明顯增加(p0.05),提示胰島素妊娠小鼠模型構建成功。2.Real-time PCR結果表明,在高胰島素的作用下妊娠D6、D7、D8天孕鼠子宮內膜組織BMP2、PRL m RNA表達顯著降低(p0.05)。Western-blot結果表明,與對照組相比較,高胰島素處理組妊娠D6、D7、D8天孕鼠子宮內膜組織BMP2、PRL蛋白表達顯著降低(p0.05)。免疫組化結果同樣顯示,在高胰島素的作用下孕鼠妊娠D8天子宮內膜BMP2表達顯著降低。3.正常妊娠小鼠孕D7、D8天子宮CD34免疫組化染色結果顯示,高水平胰島素組和對照組之間血管密度并無明顯差異,但高胰島素組血管竇的尺寸明顯小于對照組。人工誘導蛻膜化模型小鼠誘導側子宮CD34免疫組化染色結果顯示高胰島素組血管竇尺寸也明顯小于對照組。此外,在高胰島素的作用下HUVECS細胞的管腔生成能力受阻。4.Real-time PCR結果表明,在高胰島素的作用下妊娠D6、D7、D8天孕鼠子宮內膜組織VEGFA、VEGFR2 m RNA表達顯著降低(p0.05),但ANG-1、TIE2 m RNA表達顯著增加(p0.05)。Western-blot結果表明,與對照組相比較,高胰島素處理組妊娠D6、D7、D8天孕鼠子宮內膜組織VEGFA蛋白表達顯著降低(p0.05),ANG-1、TIE2蛋白表達顯著增加(p0.05)。免疫組化結果同樣顯示,在高胰島素的作用下孕鼠妊娠D7、D8天子宮內膜VEGFA表達顯著降低,ANG-1表達顯著增加。在高胰島素的作用下假孕小鼠蛻膜化誘導側子宮內膜VEGFA m RNA和蛋白表達均顯著降低(p0.05),ANG-1、TIE2 m RNA和蛋白表達均顯著增加(p0.05)。在高胰島素的作用下HUVECS細胞中血管生成相關因子的表達也受到了干擾。Western-blot結果顯示,高胰島素處理的HUVECS細胞中VEGFA蛋白表達明顯降低(p0.05)、ANG-1、TIE2的蛋白表達顯著增加(p0.05)。VEGFA免疫熒光結果顯示,在高水平胰島素的作用下VEGFA在HUVECS中的表達受到了顯著抑制。5.高水平胰島素顯著增加正常妊娠小鼠模型孕D6、D7、D8天子宮內膜中LC3-Ⅱ、Atg5、Beclin1、p-ULK1的表達,同時顯著降低P62的表達(p0.05)。高胰島素處理HUVECS細胞后LC3表達顯著增加。與單獨高胰島素處理組相比較,采用自噬抑制劑3-MA干預高胰島素處理的HUVECS后,原本受損的細胞管腔形成能力和VEGFA表達均得到改善。結論:血管生成是子宮內膜蛻膜化的重要過程,子宮內膜的血管生成是一個復雜的過程,受到多種因素的調控。本研究提示,在高胰島素的作用下子宮內膜血管生成相關標志分子表達紊亂、血管竇的延伸與擴增受到抑制。自噬可能參與了高胰島素所引起的子宮內膜蛻膜化過程中血管生成障礙這一過程,但其具體機制還有待進一步研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R714

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