【摘要】：第一部分MiR-182對瘦素誘導的卵巢癌細胞生長的影響及機制研究 研究背景 卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤,嚴重威脅婦女健康,死亡率居婦科腫瘤之首。早期診斷困難及復發(fā)轉(zhuǎn)移導致治療手段缺乏,是卵巢癌高死亡率的主要原因。因此及早捕捉預警信號并闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機制,對卵巢癌的防治至關(guān)重要,但目前相關(guān)機制尚未闡明。流行病學數(shù)據(jù)表明肥胖增加激素依賴性腫瘤(如卵巢癌)的發(fā)生風險,瘦素(Leptin)作為重要的脂肪因子類激素之一,參與調(diào)控機體的脂肪代謝,并與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌時瘦素水平升高,且與患者無病生存期密切相關(guān),但目前瘦素與卵巢癌增殖、凋亡的關(guān)系及其在卵巢癌起源中的作用尚不明確。 MicroRNA (miRNA)是一類非編碼小RNA,可在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制翻譯或者誘導降解抑制靶mRNA的功能,調(diào)節(jié)細胞分化、增殖和凋亡過程。研究表明多種腫瘤組織存在miRNAs的異常表達或者突變,并影響腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。MiR-182是重要的miRNAs分子,其過表達于輸卵管內(nèi)上皮性漿液性卵巢癌和高級別漿液性卵巢癌,并促進良性和惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)化,提示miR-182在卵巢癌的早期發(fā)生中具有重要意義,而對其進行有效調(diào)節(jié)將有助于卵巢癌的防治。研究表明瘦素可通過影響miRNAs的表達調(diào)節(jié)骨骼肌細胞的生長,但關(guān)于卵巢癌發(fā)生和發(fā)展過程中瘦素影響miRNAs表達及機制未見報道。 綜上所述,基于相關(guān)領(lǐng)域國內(nèi)外的研究進展,本課題體外研究了瘦素通路下游信號分子STAT5介導的miR-182上調(diào)對卵巢癌細胞生長和轉(zhuǎn)化的影響及機制。本研究肯定了瘦素和miR-182在卵巢癌中的作用,進一步闡明了卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機制,為卵巢癌的早期診斷和治療提供新的線索。 研究目的 1.瘦素對卵巢癌細胞生長、增殖及轉(zhuǎn)化的作用。 2.探索介導瘦素調(diào)節(jié)卵巢癌細胞生長、增殖及轉(zhuǎn)化的miRNAs及miR-182和miR-96在瘦素作用中的影響。 3.觀察瘦素下游信號通路對miR-182和miR-96的作用。 研究方法 1.卵巢癌細胞系瘦素及瘦素受體的表達 卵巢癌細胞(SKOV3和A2780)37℃C培養(yǎng)24小時,RT-PCR檢測瘦素和瘦素長型受體OB-Rb和短型受體OB-Ra表達,Western blot檢測瘦素及其受體的蛋白水平。培養(yǎng)72小時后收集上清,ELISA法檢測內(nèi)源性瘦素表達。 2.瘦素對卵巢癌細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)化的影響 分別給予SKOV3和A2780細胞不同劑量瘦素(0、10、50、100和500ng/mL),每隔24小時收集細胞,WST-1法檢測細胞增殖并繪制生長曲線。卵巢癌細胞SKOV3和A2780分為Control、Leptin、Anti-leptin、Leptin+Anti-leptin組,在0.3%的軟瓊脂中37℃C培養(yǎng)3周后,結(jié)晶紫染色觀察不同組別軟瓊脂中形成的單細胞克隆數(shù)目。卵巢癌細胞分為Control、Leptin、Anti-leptin、Leptin+Anti-leptin組37℃培養(yǎng)48小時后,流式細胞術(shù)檢測各組細胞的凋亡率,瘦素處理的結(jié)腸癌細胞-HCT-116用于陽性對照。 3.瘦素作用后卵巢癌細胞轉(zhuǎn)錄因子FOXO3表達的變化,并觀察其在瘦素調(diào)節(jié)卵母巢癌細胞增殖中的作用 卵巢癌細胞(SKOV3和A2780)分為Control、Leptin、Anti-leptin、 Leptin+Anti-leptin組,37℃C培養(yǎng)48小時后,Western blot檢測FOXO1和FOXO3蛋白水平變化,篩選表達變化的FOXO分子,然后Western Blot檢測其下游靶分子蛋白水平表達。 siRNA干擾相應FOXO分子的表達,RT-PCR和Western Blot分別從基因水平和蛋白水平檢測干擾效率,卵巢癌細胞分為Control、Leptin、Con-siRNA和FOXO-siRNA組,37℃培養(yǎng)48小時后,WST-1檢測各組細胞的增殖變化。 4.瘦素對靶向作用于FOXO分子3'-UTR的miRNAs的影響,miRNAs在卵巢癌細胞增殖中的作用 PCR克隆擴增FOXO分子的3'-UTR并構(gòu)建psiCHECK2熒光載體,用該載體及對照空載體分別轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞SKOV3和A2780。37℃培養(yǎng)24小時后,細胞分為Vector、Vector+Leptin、FOXO-3'-UTR, FOXO-3'-UTR+Leptin組并繼續(xù)培養(yǎng)48小時,雙熒光報告系統(tǒng)檢測不同組別的熒光信號強度。 卵巢癌細胞SKOV3和A2780分為Control和Leptin組,培養(yǎng)48小時后,RT-PCR檢測miRNAs分子的基因水平表達變化。用所測miRNAs的mimics轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞,37℃培養(yǎng)48小時,RT-PCR檢測各組過表達效率,Western blot檢測不同mimics轉(zhuǎn)染細胞的FOXO分子蛋白水平的變化,WST-1檢測細胞的增殖變化。用miRNAs抑制劑轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞,37℃培養(yǎng)24小時后RT-PCR檢測各組抑制效率,細胞分為Control、Leptin、Leptin+miRNAs inhibitor并繼續(xù)培養(yǎng)48小時,Western blot檢測卵巢癌細胞的FOXO分子蛋白水平的變化,WST-1檢測細胞的增殖變化。 5.瘦素受體下游信號傳導分子STAT3、STAT5在瘦素調(diào)節(jié)的miRNAs表達上調(diào)中的作用 瘦素作用卵巢癌SKOV3和A2780細胞48小時后,Western blot檢測瘦素長型受體OB-Rb表達水平的變化。 瘦素處理卵巢癌SKOV3和A2780細胞不同時間(0,15,30,60分鐘)后,Western blot檢測不同STAT信號通路蛋白(STAT3、STAT5)的表達變化。 卵巢癌SKOV3和A278048細胞分為Control、Leptin、STAT5-siRNA、 Cucurbitacin Ⅰ (p-STAT3抑制劑)、Leptin+STAT5-siRNA、Leptin+Cucurbitacin I組,RT-PCR檢測目的miRNAs分子基因表達水平變化。 研究結(jié)果 1.卵巢癌細胞表達瘦素受體 實驗表明,卵巢癌SKOV3和A2780細胞在蛋白水平和mRNA水平均可檢測到瘦素、瘦素長型受體OB-Rb和短型受體OB-Ra的表達,兩種細胞培養(yǎng)上清中也存在極低量的瘦素(分別為38.39±3.72pg/mL和35.40±2.44pg/mL),因遠低于生理劑量,后續(xù)實驗均給予外源性瘦素。 2.瘦素促進卵巢癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)化能力 瘦素以劑量依賴和時間依賴方式促進卵巢癌細胞SKOV3和A2780的增殖能力(P0.05)。同時增加軟瓊脂中兩種卵巢癌細胞克隆的數(shù)目和大小(SKOV3細胞：2.72--±0.34倍,P0.05；A2780細胞：1.97±0.15倍,P0.05),瘦素抗體可阻斷瘦素的促細胞轉(zhuǎn)化能力。流式細胞術(shù)顯示瘦素不影響卵巢癌細胞SKOV3和A2780的凋亡率(P0.05),但顯著抑制結(jié)腸癌細胞HCT-116的凋亡(P=0.0169)。 3.瘦素抑制卵巢癌細胞FOXO3的表達,從而促進細胞增殖 Western blot結(jié)果表明瘦素(100ng/ml)顯著抑制卵巢癌細胞SKOV3和A2780內(nèi)FOXO3的表達(SKOV3細胞：55.1±1.8%,P0.01；A2780細胞：48.4±10.1%,P0.01), FOXO1的表達無顯著變化(P0.05)。進一步檢測發(fā)現(xiàn)瘦素(100ng/ml)顯著抑制細胞內(nèi)FOXO3的兩個下游靶基因Bim (SKOV3細胞：45.8±1.50%,P0.01；A2780細胞：46.7±3.6%,P0.01)和p27(SKOV3細胞：41.4±6.3%,P0.01；A2780細胞：36.7±9.0%,P0.01)的表達。利用FOXO3-siRNA干擾掉細胞內(nèi)FOXO3基因和蛋白表達后,發(fā)現(xiàn)兩種細胞的增殖能力均顯著增強(SKOV3細胞：1.63±0.10倍,P0.01；A2780細胞：1.59±0.16倍,P0.05)。 4.瘦素通過上調(diào)靶向作用于FOXO33'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)的miRNAs抑制FOXO3表達,從而促進卵巢癌細胞增殖 利用包含F(xiàn)OXO33'-UTR的psiCHECK2熒光載體轉(zhuǎn)染細胞后,雙熒光報告系統(tǒng)顯示瘦素(100ng/ml)顯著降低卵巢癌細胞SKOV3和A2780內(nèi)的熒光素酶強度(SKOV3細胞：53.4±2.5%,P=0.001；A2780細胞：41.6±8.5%,P=0.016)。RT-PCR結(jié)果顯示瘦素(100ng/ml)顯著上調(diào)SKOV3細胞中靶向作用于FOXO3的腫瘤相關(guān)miRNAs,包括miR-182(2.26±0.23倍,P0.01)、miR-106(1.52±0.16倍,P=0.03)、miR-96(1.91±0.03倍,P0.01)和miR-155(1.53±0.10倍,P=0.01),對A2780細胞中的上述miRNAs具有相似的作用。但兩種細胞miR-93和miR-153的表達均不受瘦素影響(P0.05)。 上述六種miRNAs的]mimics分別轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞SKOV3和A2780, Westernblot顯示miR-182(SKOV3細胞：64.8%±11.4%,P0.05；A2780細胞：51.8%±0.5%,P0.05)和miR-96(SKOV3細胞：58.3%±2.5%,P0.05；A2780細胞：42.2%±4.1%,P0.05)兩種mimics可以有效抑制兩種細胞內(nèi)FOX03的表達,miR-155和miR-106a的mimics則不具備此功能(P0.05)。利用抑制劑干擾阻斷兩種細胞內(nèi)miR-182和miR-96的表達后,Leptin對FOX03表達的抑制作用亦消失。WST-1檢測兩種細胞的增殖發(fā)現(xiàn),miR-182(SKOV3細胞：2.65±0.05倍,P0.01；A2780細胞：2.52±0.06倍,P0.01)和miR-96(SKOV3細胞：2.03±0.08倍,P0.01；A2780細胞：1.85±0.13倍,P0.05)的mimics可促進兩種細胞的增殖,而miR-182(SKOV3細胞：37.1%±3.3%,P0.01；A2780細胞：37.4%±5.0%,P0.01)和miR-96(SKOV3細胞：28.9%±6.2%,P0.01；A2780細胞：29.9%±3.5%,P0.01)抑制劑則可有效抑制瘦素對兩種細胞的促增殖效應。 5.瘦素通過STAT5通路上調(diào)細胞中miR-182和miR-96的表達 瘦素(100ng/ml)能夠促進卵巢癌細胞SKOV3和A2780瘦素長型受體OB-Rb的表達。同時瘦素可活化瘦素受體下游信號通路STAT3和STAT5,分別在60、30分鐘活化達到高峰,特異性阻斷兩個通路發(fā)現(xiàn)cucurbitacin Ⅰ (STAT3抑制劑)不影響瘦素誘導的miR-182和miR-96表達上調(diào)(P0.05),而STAT5-siRNA能夠降低瘦素導致的miR-182(SKOV3細胞：43.5%±2.5%,P0.01；A2780細胞：32.0%±9.4%,P0.01)和miR-96(SKOV3細胞：34.1%±0.8%,P0.01；A2780細胞：22.7%±4.2%,P0.05)表達上調(diào),表明STAT5通路參與miR-182和miR-96依賴的FOXO3抑制和細胞增殖。 結(jié)論 1.MiR-182和miR-96在瘦素抑制FOXO3表達、進而促進抑卵巢癌細胞增殖這一過程中發(fā)揮重要的介導作用。 2.瘦素通過下游STAT5信號途徑上調(diào)卵巢癌細胞miR-182和miR-96的表達。 第二部分抗mi R-182化合物對卵巢癌體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移的影響及機制研究 研究背景 卵巢癌是女性死亡率最高的生殖系統(tǒng)腫瘤,高級別漿液性卵巢癌是卵巢癌中侵襲程度最高的類型,多數(shù)患者確診時已屬晚期,腫瘤已出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移�，F(xiàn)有的手術(shù)治療和化療可在一定程度上減少腫瘤負荷,但對患者遠期生存率并無顯著影響。近年來抗microRNA治療(anti-microRN A)成為癌癥治療的一種潛在有效的途徑。miRNAs為一種小分子非編碼RNA,某些miRNAs與腫瘤的生長、侵襲和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其中miR-182是一種原癌miRNAs,可負性調(diào)節(jié)多種與腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)有關(guān)的抑癌基因,從而促進多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 研究表明miR-182過表達與高級別漿液性卵巢癌,與腫瘤的生長及侵襲密切相關(guān),且與患者的不良預后有關(guān)。本課題組前期發(fā)現(xiàn)miR-182在瘦素介導的促卵巢癌細胞增殖和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,因此在miR-182過表達的卵巢癌中,anti-miR-182治療可能會減少腫瘤負荷、抑制侵襲轉(zhuǎn)移。綜上所述,基于本課題國內(nèi)外的研究進展及課題組的前期工作基礎(chǔ),本課題組首次嘗試應用anti-miR-182進行卵巢癌治療。我們將人卵巢癌細胞固定植入小鼠卵巢包膜內(nèi),成功構(gòu)建了小鼠原位卵巢癌模型,并給予小鼠anti-miR-182系統(tǒng)治療,應用在體生物光學成像技術(shù)動態(tài)監(jiān)測腫瘤的生長轉(zhuǎn)移,治療結(jié)束后用組織病理學手段確認了腫瘤在小鼠各臟器的侵襲轉(zhuǎn)移情況及藥物的作用,并進一步對腫瘤組織中miR-182靶基因的表達情況進行了分子生物學分析。本研究為侵襲性高級別漿液性卵巢癌提供了一種潛在的新的治療手段。 研究目的 1.模擬人卵巢癌構(gòu)建小鼠原位卵巢癌模型。 2.給與小鼠anti-miR-182治療,動態(tài)觀察藥物對腫瘤生長和侵襲的影響。 3.組織學觀察藥物對腫瘤生長和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。 4.分析anti-miR-182影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制。 研究方法 1.體外檢測anti-miR-182對卵巢癌細胞的影響 體外實驗利用人卵巢癌細胞系OVCAR3、HEY和SKOV3細胞,應用慢病毒包裝轉(zhuǎn)染系統(tǒng)構(gòu)建miR-182穩(wěn)定過表達的HEY和SKOV3細胞系。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將anti-miR-182瞬時導入上述卵巢癌細胞系,細胞分為Control、 anti-miR-182組,37℃C培養(yǎng)48小時后RT-PCR檢測細胞內(nèi)miR-182的基因水平,Western blot檢測miR-182靶基因的蛋白水平。 將anti-miR-182利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入卵巢癌細胞OVCAR3、HEY和SKOV3,37℃培養(yǎng)24小時后,1)Transwell侵襲實驗檢測卵巢癌細胞侵襲能力的變化；2)將Control細胞和anti-miR-182分別種在5個96孔板上(2×103每孔,每種細胞每板5個復孔),利用WST-1連續(xù)五天每天檢測細胞的增殖并繪制生長曲線；3)軟瓊脂克隆形成實驗檢測卵巢癌細胞非停泊性生長能力的變化。 2.構(gòu)建裸鼠原位人卵巢癌模型 利用慢病毒包裝轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將熒光素酶基因?qū)敕�(wěn)定過表達miR-182的SKOV3卵巢癌細胞(SKOV3-miR-182-luc),該熒光素酶與底物作用后可被在體生物光學成像系統(tǒng)檢測(IVIS)。 SKOV3-miR-182-luc消化計數(shù)后,利用Ⅳ型膠原將腫瘤細胞(106個細胞)固定成直徑約0.2厘米的球狀小團,顯微鏡下手術(shù)將細胞團塊植入8周齡裸鼠左側(cè)卵巢包膜內(nèi)。 3. Anti-miR-182治療 術(shù)后小鼠隨機分成對照組(20只)和anti-miR-182實驗組(20只),并于術(shù)后第三天分別腹腔注射安慰劑或anti-miR-182(25mg/kg),每周兩次,整個治療周期為8周(其中實驗組4只動物僅治療1周)。 4. Anti-miR-182對卵巢原發(fā)腫瘤生長的影響 治療期間每周一次應用IVIS技術(shù)動態(tài)監(jiān)測對照組和實驗組腫瘤的生長和侵襲,利用軟件定量分析兩組動物腫瘤信號強度。 8周后處死小鼠,測量對照組和實驗組腫瘤實際長短徑線,收集冰凍所有小鼠血清和部分腫瘤、肝臟組織,切除小鼠所有器官(肝、腎、脾、胰腺、腸道組織、子宮輸卵管、卵巢腫瘤及對側(cè)卵巢、肺、心臟)并固定備用。 ELISA檢測對照組和實驗組血清中CA125的水平。提取對照組和實驗組腫瘤組織總RNA, RT-PCR檢測兩組腫瘤組織內(nèi)與細胞周期調(diào)節(jié)或細胞死亡有關(guān)(CDKN1A、CDKN1B、FOXO1、CHEK2)的基因表達水平。 5.Anti-miR-182對卵巢腫瘤侵襲遠處轉(zhuǎn)移的影響 IVIS技術(shù)動態(tài)監(jiān)測對照組和實驗組原發(fā)瘤的轉(zhuǎn)移信號。對兩組動物所有器官進行組織切片和HE染色,顯微鏡下觀察個臟器轉(zhuǎn)移瘤的情況并進行統(tǒng)計分析。 6.腫瘤組織的分子生物學水平分析 提取對照組和實驗組動物腫瘤及血清中的總RNA, RT和實時定量PCR檢測腫瘤即血清中miR-182及其同一基因簇miR-183和miR-96的基因表達。提取兩組動物腫瘤組織內(nèi)的總蛋白,Western blot檢測兩組腫瘤組織內(nèi)miR-182靶基因(BRCA1、MTSS1、FOX03)和誘導基因HMGA2的蛋白水平變化。 7. Anti-miR-182治療對腫瘤微環(huán)境的影響 對對照組和實驗組腫瘤組織切片和HE染色,鏡下觀察腫瘤與卵巢、輸卵管和卵巢周圍脂肪組織的關(guān)系,免疫組織化學染色確定腫瘤周圍微環(huán)境中的細胞成分。炎癥基因芯片技術(shù)觀察兩組腫瘤組織內(nèi)炎癥基因譜的變化。RT-PCR檢測對照組和實驗組(各8例)腫瘤內(nèi)趨化因子和細胞因子(CCL2、IL-6、IL-8、TNF-α、 IFN-γ)的基因水平變化。 人卵巢癌細胞系SKOV3分為Control組、anti-miR-182組、miR-182過表達組、miR-182過表達+anti-miR-182組,37℃培養(yǎng)48小時后RT-PCR檢測細胞內(nèi)CCL2基因水平的變化。 8.藥物毒性分析 8周治療結(jié)束后,收集對照組和anti-miR-182實驗動物的全部器官(肝臟、胰腺、胃腸道、腎、脾及子宮)并進行組織切片和HE染色,鏡下觀察兩組組織內(nèi)細胞的形態(tài)學變化,判斷藥物的毒性作用。 研究結(jié)果 1. Anti-miR-182抑制體外卵巢癌細胞的增殖、基質(zhì)膠侵襲和轉(zhuǎn)化能力 RT-PCR結(jié)果顯示anti-miR-182顯著抑制OVCAR3、HEY-miR-182和SKOV3-miR-182細胞內(nèi)miR-182的基因水平(P0.001)。Western blot結(jié)果顯示,anti-miR-182顯著上調(diào)SKOV3-miR-182細胞內(nèi)miR-182靶基因FOXO3(1.47±0.18倍,P0.05)、BRCAl (3.09±0.99倍,P0.05)、和MTSS1(1.39±0.18倍,P0.05)的蛋白水平,同時下調(diào)miR-182誘導的HMGA2(62.6%±17.2%,P0.01)的蛋白表達,對OVCAR3和HEY-miR-182細胞具有相似效應。 基質(zhì)膠侵襲實驗結(jié)果顯示anti-miR-182可顯著抑制SKOV3-miR-182細胞的侵襲能力(抑制率57.1%±7.9%,P0.001)。軟瓊脂克隆形成實驗表明anti-miR-182可顯著減少單細胞克隆形成數(shù)目和大小(抑制率54.8%±16.3%,P0.01)。WST-1細胞增殖實驗結(jié)果顯示anti-miR-182抑制SKOV3-miR-182細胞的體外增殖(第3天,P0.05；第四天P0.05；第五天P0.01)。 2.構(gòu)建裸鼠原位人卵巢癌模型 將SKOV3-miR-182-luc細胞包埋入Ⅳ型膠原并植入裸鼠左側(cè)卵巢包膜內(nèi),術(shù)后第二天,IVIS檢測結(jié)果表明所有小鼠熒光信號相同(相對熒光強度3-3.5x109),表明卵巢癌細胞植入量在所有動物體內(nèi)基本一致,無腹腔泄漏。 3. Anti-miR-182治療抑制卵巢癌腫瘤的體內(nèi)生長 術(shù)后第3天,小鼠被隨機分為對照組和anti-miR-182實驗組并分別給予安慰劑或anti-miR-182腹腔注射治療,治療劑量25mg/kg,一周兩次,整個療程為8周。IVIS圖像顯示從治療第5周開始,實驗組與對照組腫瘤大小之間開始出現(xiàn)差異(對照組信號強度為(17.73±7.72)×109,實驗組信號強度為(5.20±6.63)×109,P0.01),且該差異隨著治療時間延長而增大。 處死小鼠測量兩組小鼠卵巢腫瘤實際大小發(fā)現(xiàn)表明anti-miR-182治療組的腫瘤(5.42±1.00mm,90.59±37.31mm3)顯著小于對照組(8.07±1.74mm,310.89±187.12mm3),其最長徑線較對照組減少38%,體積較對照組減少70.9%(P0.01). ELISA結(jié)果顯示對照組小鼠血清CA125水平高于實驗組小鼠(P=0.06)。 RT-實時定量PCR結(jié)果顯示,mti-miR-182顯著上調(diào)腫瘤組織內(nèi)與細胞生長和死亡有關(guān)的miR-182假定靶基因CDKN1A(P=0.0199)、CDKN1B(P=0.0156)、 FOXO1(P0.0001)、CHEK2(P0.0001)。 4. Anti-miR-182治療抑制小鼠體內(nèi)卵巢癌細胞的侵襲和遠處轉(zhuǎn)移 治療第8周IVIS圖像顯示,對照組腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移率為28%(5/8),實驗組的轉(zhuǎn)移率為7%(1/15)。組織學分析結(jié)果顯示對照組77.8%(14/18)的動物存在至少一處轉(zhuǎn)移癌灶,實驗組33.3%(5/15)的動物存在至少一處轉(zhuǎn)移灶；對照組共發(fā)現(xiàn)31個轉(zhuǎn)移瘤,實驗組僅發(fā)現(xiàn)6個轉(zhuǎn)移瘤。對照組和實驗組腫瘤遠處轉(zhuǎn)移率具有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.05)。轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目由多到少的部位是依次是脾臟(對照組陽性率為44%,8/18；實驗組陽性率為20%,3/15)、大網(wǎng)膜(對照組陽性率為28%,5/18；實驗組陽性率為13%,2/15)、胰腺(對照組陽性率為22%,4/18；實驗組陽性率為0%)、和肝臟(對照組陽性率為11%,2/18；實驗組陽性率為0%)。與其他部位的轉(zhuǎn)移瘤相比,胰腺轉(zhuǎn)移瘤更大、侵襲性更強。對照組有一只小鼠發(fā)生了對側(cè)卵巢轉(zhuǎn)移。雖然腎實質(zhì)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤,對照組50%(9/18)的動物的卵巢腫瘤與同側(cè)發(fā)生腎粘連,而anti-miR-182治療組動物未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象(0/15)。對照組和實驗組動物均未發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移灶。 5. Anti-miR-182治療后腫瘤組織的分子生物學分析 實時定量PCR結(jié)果顯示與對照組腫瘤相比,anti-miR-182治療組的腫瘤組織內(nèi)miR-182表達水平極低(降低94.9%±13.3%)或低于測量范圍(P0.001),同時顯著降低miR-183的表達(降低92.5%0±9.7%,P0.001),但對miR-96的表達無影響(P0.05)。小鼠血清內(nèi)miR-182(降低53.2%±10.4%,P0.01)和miR-183(降低84.3%±20.6%,P0.01)的水平也顯著降低。 Western blot結(jié)果顯示經(jīng)anti-miR-182治療后腫瘤內(nèi)miR-182的靶基因BRCA1(2.63±0.35倍,P0.01)、FOXO3(1.4±0.18倍,P0.01)和MTSS1(2.63±1.29倍,P0.01)與對照組相比顯著上調(diào),而miR-182誘導的基因HMGA2表達下調(diào)(降低71.5%±4.0%,P0.01)。 6. Anti-miR-182治療誘導的炎癥反應抑制腫瘤的侵襲 組織學觀察發(fā)現(xiàn)anti-miR-182治療組73.3%(11/15)的小鼠腫瘤細胞植入部位(卵巢旁軟組織)有大量單核細胞浸潤,對照組雖有16.7%(3/18)的動物存在單核細胞浸潤,但單核細胞數(shù)量明顯少于實驗組。免疫組織化學染色證實了浸潤細胞為KP1陽性小鼠單核細胞。單核細胞浸潤少的腫瘤表現(xiàn)出浸潤生長模式,并穿透卵巢包膜侵入周圍脂肪組織,而周圍有大量單核細胞浸潤的腫瘤則局限于卵巢包膜內(nèi)。 炎癥基因譜分析顯示對照組腫瘤與anti-miR-182治療組腫瘤組織炎癥基因譜發(fā)生改變。實時定量PCR結(jié)果表明與對照組相比,實驗組腫瘤組織內(nèi)CCL2(P0.0001). IL-6(P=0.0019)、IL-8(P=0.0002)、TNF-α (P=0.0088)、IFN-γ(P0.0001)的表達顯著上調(diào)。體外實驗表明,無論在初始SKOV3細胞還是SKOV3-miR-182細胞,anti-miR-182均可顯著上調(diào)細胞內(nèi)CCL2的基因表達(SKOV3細胞：3.6±0.73倍,P0.001；SKOV3-miR-182細胞：11.39±0.21倍,P0.001)。 7.Anti-miR-182治療對小鼠無明顯不良組織毒性作用 組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)8周anti-miR-182治療后,小鼠的肝臟、胰腺、胃腸道、腎、脾及子宮均無顯著的組織學和細胞學變化。 結(jié)論 1.建立的裸鼠原位卵巢癌模型可成功模擬人原發(fā)性卵巢癌的生長和侵襲模式,適用于卵巢癌的體內(nèi)研究。 2.Anti-miR-182體內(nèi)、體外均可通過下調(diào)miR-182、恢復其靶分子的表達有效抑制人卵巢癌細胞的增殖、侵襲和遠處轉(zhuǎn)移；同時anti-miR-182可誘導腫瘤局部炎癥反應抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。 3. Anti-miR-182體內(nèi)應用無不良組織學毒性作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【共引文獻】

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3 田，

本文編號：2470707