【摘要】：第一部分MiR-182對(duì)瘦素誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制研究 研究背景 卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅婦女健康,死亡率居?jì)D科腫瘤之首。早期診斷困難及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致治療手段缺乏,是卵巢癌高死亡率的主要原因。因此及早捕捉預(yù)警信號(hào)并闡明卵巢癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子機(jī)制,對(duì)卵巢癌的防治至關(guān)重要,但目前相關(guān)機(jī)制尚未闡明。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明肥胖增加激素依賴性腫瘤(如卵巢癌)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),瘦素(Leptin)作為重要的脂肪因子類激素之一,參與調(diào)控機(jī)體的脂肪代謝,并與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌時(shí)瘦素水平升高,且與患者無病生存期密切相關(guān),但目前瘦素與卵巢癌增殖、凋亡的關(guān)系及其在卵巢癌起源中的作用尚不明確。 MicroRNA (miRNA)是一類非編碼小RNA,可在轉(zhuǎn)錄后水平通過抑制翻譯或者誘導(dǎo)降解抑制靶mRNA的功能,調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和凋亡過程。研究表明多種腫瘤組織存在miRNAs的異常表達(dá)或者突變,并影響腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。MiR-182是重要的miRNAs分子,其過表達(dá)于輸卵管內(nèi)上皮性漿液性卵巢癌和高級(jí)別漿液性卵巢癌,并促進(jìn)良性和惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)化,提示miR-182在卵巢癌的早期發(fā)生中具有重要意義,而對(duì)其進(jìn)行有效調(diào)節(jié)將有助于卵巢癌的防治。研究表明瘦素可通過影響miRNAs的表達(dá)調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞的生長(zhǎng),但關(guān)于卵巢癌發(fā)生和發(fā)展過程中瘦素影響miRNAs表達(dá)及機(jī)制未見報(bào)道。 綜上所述,基于相關(guān)領(lǐng)域國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展,本課題體外研究了瘦素通路下游信號(hào)分子STAT5介導(dǎo)的miR-182上調(diào)對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化的影響及機(jī)制。本研究肯定了瘦素和miR-182在卵巢癌中的作用,進(jìn)一步闡明了卵巢癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,為卵巢癌的早期診斷和治療提供新的線索。 研究目的 1.瘦素對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)化的作用。 2.探索介導(dǎo)瘦素調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)化的miRNAs及miR-182和miR-96在瘦素作用中的影響。 3.觀察瘦素下游信號(hào)通路對(duì)miR-182和miR-96的作用。 研究方法 1.卵巢癌細(xì)胞系瘦素及瘦素受體的表達(dá) 卵巢癌細(xì)胞(SKOV3和A2780)37℃C培養(yǎng)24小時(shí),RT-PCR檢測(cè)瘦素和瘦素長(zhǎng)型受體OB-Rb和短型受體OB-Ra表達(dá),Western blot檢測(cè)瘦素及其受體的蛋白水平。培養(yǎng)72小時(shí)后收集上清,ELISA法檢測(cè)內(nèi)源性瘦素表達(dá)。 2.瘦素對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)化的影響 分別給予SKOV3和A2780細(xì)胞不同劑量瘦素(0、10、50、100和500ng/mL),每隔24小時(shí)收集細(xì)胞,WST-1法檢測(cè)細(xì)胞增殖并繪制生長(zhǎng)曲線。卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780分為Control、Leptin、Anti-leptin、Leptin+Anti-leptin組,在0.3%的軟瓊脂中37℃C培養(yǎng)3周后,結(jié)晶紫染色觀察不同組別軟瓊脂中形成的單細(xì)胞克隆數(shù)目。卵巢癌細(xì)胞分為Control、Leptin、Anti-leptin、Leptin+Anti-leptin組37℃培養(yǎng)48小時(shí)后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率,瘦素處理的結(jié)腸癌細(xì)胞-HCT-116用于陽(yáng)性對(duì)照。 3.瘦素作用后卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子FOXO3表達(dá)的變化,并觀察其在瘦素調(diào)節(jié)卵母巢癌細(xì)胞增殖中的作用 卵巢癌細(xì)胞(SKOV3和A2780)分為Control、Leptin、Anti-leptin、 Leptin+Anti-leptin組,37℃C培養(yǎng)48小時(shí)后,Western blot檢測(cè)FOXO1和FOXO3蛋白水平變化,篩選表達(dá)變化的FOXO分子,然后Western Blot檢測(cè)其下游靶分子蛋白水平表達(dá)。 siRNA干擾相應(yīng)FOXO分子的表達(dá),RT-PCR和Western Blot分別從基因水平和蛋白水平檢測(cè)干擾效率,卵巢癌細(xì)胞分為Control、Leptin、Con-siRNA和FOXO-siRNA組,37℃培養(yǎng)48小時(shí)后,WST-1檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖變化。 4.瘦素對(duì)靶向作用于FOXO分子3'-UTR的miRNAs的影響,miRNAs在卵巢癌細(xì)胞增殖中的作用 PCR克隆擴(kuò)增FOXO分子的3'-UTR并構(gòu)建psiCHECK2熒光載體,用該載體及對(duì)照空載體分別轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780。37℃培養(yǎng)24小時(shí)后,細(xì)胞分為Vector、Vector+Leptin、FOXO-3'-UTR, FOXO-3'-UTR+Leptin組并繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),雙熒光報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)不同組別的熒光信號(hào)強(qiáng)度。 卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780分為Control和Leptin組,培養(yǎng)48小時(shí)后,RT-PCR檢測(cè)miRNAs分子的基因水平表達(dá)變化。用所測(cè)miRNAs的mimics轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞,37℃培養(yǎng)48小時(shí),RT-PCR檢測(cè)各組過表達(dá)效率,Western blot檢測(cè)不同mimics轉(zhuǎn)染細(xì)胞的FOXO分子蛋白水平的變化,WST-1檢測(cè)細(xì)胞的增殖變化。用miRNAs抑制劑轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞,37℃培養(yǎng)24小時(shí)后RT-PCR檢測(cè)各組抑制效率,細(xì)胞分為Control、Leptin、Leptin+miRNAs inhibitor并繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí),Western blot檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞的FOXO分子蛋白水平的變化,WST-1檢測(cè)細(xì)胞的增殖變化。 5.瘦素受體下游信號(hào)傳導(dǎo)分子STAT3、STAT5在瘦素調(diào)節(jié)的miRNAs表達(dá)上調(diào)中的作用 瘦素作用卵巢癌SKOV3和A2780細(xì)胞48小時(shí)后,Western blot檢測(cè)瘦素長(zhǎng)型受體OB-Rb表達(dá)水平的變化。 瘦素處理卵巢癌SKOV3和A2780細(xì)胞不同時(shí)間(0,15,30,60分鐘)后,Western blot檢測(cè)不同STAT信號(hào)通路蛋白(STAT3、STAT5)的表達(dá)變化。 卵巢癌SKOV3和A278048細(xì)胞分為Control、Leptin、STAT5-siRNA、 Cucurbitacin Ⅰ (p-STAT3抑制劑)、Leptin+STAT5-siRNA、Leptin+Cucurbitacin I組,RT-PCR檢測(cè)目的miRNAs分子基因表達(dá)水平變化。 研究結(jié)果 1.卵巢癌細(xì)胞表達(dá)瘦素受體 實(shí)驗(yàn)表明,卵巢癌SKOV3和A2780細(xì)胞在蛋白水平和mRNA水平均可檢測(cè)到瘦素、瘦素長(zhǎng)型受體OB-Rb和短型受體OB-Ra的表達(dá),兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清中也存在極低量的瘦素(分別為38.39±3.72pg/mL和35.40±2.44pg/mL),因遠(yuǎn)低于生理劑量,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均給予外源性瘦素。 2.瘦素促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)化能力 瘦素以劑量依賴和時(shí)間依賴方式促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780的增殖能力(P0.05)。同時(shí)增加軟瓊脂中兩種卵巢癌細(xì)胞克隆的數(shù)目和大小(SKOV3細(xì)胞：2.72--±0.34倍,P0.05；A2780細(xì)胞：1.97±0.15倍,P0.05),瘦素抗體可阻斷瘦素的促細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力。流式細(xì)胞術(shù)顯示瘦素不影響卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780的凋亡率(P0.05),但顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的凋亡(P=0.0169)。 3.瘦素抑制卵巢癌細(xì)胞FOXO3的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖 Western blot結(jié)果表明瘦素(100ng/ml)顯著抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780內(nèi)FOXO3的表達(dá)(SKOV3細(xì)胞：55.1±1.8%,P0.01；A2780細(xì)胞：48.4±10.1%,P0.01), FOXO1的表達(dá)無顯著變化(P0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)瘦素(100ng/ml)顯著抑制細(xì)胞內(nèi)FOXO3的兩個(gè)下游靶基因Bim (SKOV3細(xì)胞：45.8±1.50%,P0.01；A2780細(xì)胞：46.7±3.6%,P0.01)和p27(SKOV3細(xì)胞：41.4±6.3%,P0.01；A2780細(xì)胞：36.7±9.0%,P0.01)的表達(dá)。利用FOXO3-siRNA干擾掉細(xì)胞內(nèi)FOXO3基因和蛋白表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞的增殖能力均顯著增強(qiáng)(SKOV3細(xì)胞：1.63±0.10倍,P0.01；A2780細(xì)胞：1.59±0.16倍,P0.05)。 4.瘦素通過上調(diào)靶向作用于FOXO33'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)的miRNAs抑制FOXO3表達(dá),從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖 利用包含F(xiàn)OXO33'-UTR的psiCHECK2熒光載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,雙熒光報(bào)告系統(tǒng)顯示瘦素(100ng/ml)顯著降低卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780內(nèi)的熒光素酶強(qiáng)度(SKOV3細(xì)胞：53.4±2.5%,P=0.001；A2780細(xì)胞：41.6±8.5%,P=0.016)。RT-PCR結(jié)果顯示瘦素(100ng/ml)顯著上調(diào)SKOV3細(xì)胞中靶向作用于FOXO3的腫瘤相關(guān)miRNAs,包括miR-182(2.26±0.23倍,P0.01)、miR-106(1.52±0.16倍,P=0.03)、miR-96(1.91±0.03倍,P0.01)和miR-155(1.53±0.10倍,P=0.01),對(duì)A2780細(xì)胞中的上述miRNAs具有相似的作用。但兩種細(xì)胞miR-93和miR-153的表達(dá)均不受瘦素影響(P0.05)。 上述六種miRNAs的]mimics分別轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780, Westernblot顯示miR-182(SKOV3細(xì)胞：64.8%±11.4%,P0.05；A2780細(xì)胞：51.8%±0.5%,P0.05)和miR-96(SKOV3細(xì)胞：58.3%±2.5%,P0.05；A2780細(xì)胞：42.2%±4.1%,P0.05)兩種mimics可以有效抑制兩種細(xì)胞內(nèi)FOX03的表達(dá),miR-155和miR-106a的mimics則不具備此功能(P0.05)。利用抑制劑干擾阻斷兩種細(xì)胞內(nèi)miR-182和miR-96的表達(dá)后,Leptin對(duì)FOX03表達(dá)的抑制作用亦消失。WST-1檢測(cè)兩種細(xì)胞的增殖發(fā)現(xiàn),miR-182(SKOV3細(xì)胞：2.65±0.05倍,P0.01；A2780細(xì)胞：2.52±0.06倍,P0.01)和miR-96(SKOV3細(xì)胞：2.03±0.08倍,P0.01；A2780細(xì)胞：1.85±0.13倍,P0.05)的mimics可促進(jìn)兩種細(xì)胞的增殖,而miR-182(SKOV3細(xì)胞：37.1%±3.3%,P0.01；A2780細(xì)胞：37.4%±5.0%,P0.01)和miR-96(SKOV3細(xì)胞：28.9%±6.2%,P0.01；A2780細(xì)胞：29.9%±3.5%,P0.01)抑制劑則可有效抑制瘦素對(duì)兩種細(xì)胞的促增殖效應(yīng)。 5.瘦素通過STAT5通路上調(diào)細(xì)胞中miR-182和miR-96的表達(dá) 瘦素(100ng/ml)能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780瘦素長(zhǎng)型受體OB-Rb的表達(dá)。同時(shí)瘦素可活化瘦素受體下游信號(hào)通路STAT3和STAT5,分別在60、30分鐘活化達(dá)到高峰,特異性阻斷兩個(gè)通路發(fā)現(xiàn)cucurbitacin Ⅰ (STAT3抑制劑)不影響瘦素誘導(dǎo)的miR-182和miR-96表達(dá)上調(diào)(P0.05),而STAT5-siRNA能夠降低瘦素導(dǎo)致的miR-182(SKOV3細(xì)胞：43.5%±2.5%,P0.01；A2780細(xì)胞：32.0%±9.4%,P0.01)和miR-96(SKOV3細(xì)胞：34.1%±0.8%,P0.01；A2780細(xì)胞：22.7%±4.2%,P0.05)表達(dá)上調(diào),表明STAT5通路參與miR-182和miR-96依賴的FOXO3抑制和細(xì)胞增殖。 結(jié)論 1.MiR-182和miR-96在瘦素抑制FOXO3表達(dá)、進(jìn)而促進(jìn)抑卵巢癌細(xì)胞增殖這一過程中發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用。 2.瘦素通過下游STAT5信號(hào)途徑上調(diào)卵巢癌細(xì)胞miR-182和miR-96的表達(dá)。 第二部分抗mi R-182化合物對(duì)卵巢癌體內(nèi)生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及機(jī)制研究 研究背景 卵巢癌是女性死亡率最高的生殖系統(tǒng)腫瘤,高級(jí)別漿液性卵巢癌是卵巢癌中侵襲程度最高的類型,多數(shù)患者確診時(shí)已屬晚期,腫瘤已出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移�，F(xiàn)有的手術(shù)治療和化療可在一定程度上減少腫瘤負(fù)荷,但對(duì)患者遠(yuǎn)期生存率并無顯著影響。近年來抗microRNA治療(anti-microRN A)成為癌癥治療的一種潛在有效的途徑。miRNAs為一種小分子非編碼RNA,某些miRNAs與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。其中miR-182是一種原癌miRNAs,可負(fù)性調(diào)節(jié)多種與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)有關(guān)的抑癌基因,從而促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 研究表明miR-182過表達(dá)與高級(jí)別漿液性卵巢癌,與腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲密切相關(guān),且與患者的不良預(yù)后有關(guān)。本課題組前期發(fā)現(xiàn)miR-182在瘦素介導(dǎo)的促卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,因此在miR-182過表達(dá)的卵巢癌中,anti-miR-182治療可能會(huì)減少腫瘤負(fù)荷、抑制侵襲轉(zhuǎn)移。綜上所述,基于本課題國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展及課題組的前期工作基礎(chǔ),本課題組首次嘗試應(yīng)用anti-miR-182進(jìn)行卵巢癌治療。我們將人卵巢癌細(xì)胞固定植入小鼠卵巢包膜內(nèi),成功構(gòu)建了小鼠原位卵巢癌模型,并給予小鼠anti-miR-182系統(tǒng)治療,應(yīng)用在體生物光學(xué)成像技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移,治療結(jié)束后用組織病理學(xué)手段確認(rèn)了腫瘤在小鼠各臟器的侵襲轉(zhuǎn)移情況及藥物的作用,并進(jìn)一步對(duì)腫瘤組織中miR-182靶基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分子生物學(xué)分析。本研究為侵襲性高級(jí)別漿液性卵巢癌提供了一種潛在的新的治療手段。 研究目的 1.模擬人卵巢癌構(gòu)建小鼠原位卵巢癌模型。 2.給與小鼠anti-miR-182治療,動(dòng)態(tài)觀察藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲的影響。 3.組織學(xué)觀察藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移的作用。 4.分析anti-miR-182影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。 研究方法 1.體外檢測(cè)anti-miR-182對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響 體外實(shí)驗(yàn)利用人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3、HEY和SKOV3細(xì)胞,應(yīng)用慢病毒包裝轉(zhuǎn)染系統(tǒng)構(gòu)建miR-182穩(wěn)定過表達(dá)的HEY和SKOV3細(xì)胞系。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將anti-miR-182瞬時(shí)導(dǎo)入上述卵巢癌細(xì)胞系,細(xì)胞分為Control、 anti-miR-182組,37℃C培養(yǎng)48小時(shí)后RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-182的基因水平,Western blot檢測(cè)miR-182靶基因的蛋白水平。 將anti-miR-182利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入卵巢癌細(xì)胞OVCAR3、HEY和SKOV3,37℃培養(yǎng)24小時(shí)后,1)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的變化；2)將Control細(xì)胞和anti-miR-182分別種在5個(gè)96孔板上(2×103每孔,每種細(xì)胞每板5個(gè)復(fù)孔),利用WST-1連續(xù)五天每天檢測(cè)細(xì)胞的增殖并繪制生長(zhǎng)曲線；3)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞非停泊性生長(zhǎng)能力的變化。 2.構(gòu)建裸鼠原位人卵巢癌模型 利用慢病毒包裝轉(zhuǎn)染系統(tǒng)將熒光素酶基因?qū)敕�(wěn)定過表達(dá)miR-182的SKOV3卵巢癌細(xì)胞(SKOV3-miR-182-luc),該熒光素酶與底物作用后可被在體生物光學(xué)成像系統(tǒng)檢測(cè)(IVIS)。 SKOV3-miR-182-luc消化計(jì)數(shù)后,利用Ⅳ型膠原將腫瘤細(xì)胞(106個(gè)細(xì)胞)固定成直徑約0.2厘米的球狀小團(tuán),顯微鏡下手術(shù)將細(xì)胞團(tuán)塊植入8周齡裸鼠左側(cè)卵巢包膜內(nèi)。 3. Anti-miR-182治療 術(shù)后小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(20只)和anti-miR-182實(shí)驗(yàn)組(20只),并于術(shù)后第三天分別腹腔注射安慰劑或anti-miR-182(25mg/kg),每周兩次,整個(gè)治療周期為8周(其中實(shí)驗(yàn)組4只動(dòng)物僅治療1周)。 4. Anti-miR-182對(duì)卵巢原發(fā)腫瘤生長(zhǎng)的影響 治療期間每周一次應(yīng)用IVIS技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲,利用軟件定量分析兩組動(dòng)物腫瘤信號(hào)強(qiáng)度。 8周后處死小鼠,測(cè)量對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤實(shí)際長(zhǎng)短徑線,收集冰凍所有小鼠血清和部分腫瘤、肝臟組織,切除小鼠所有器官(肝、腎、脾、胰腺、腸道組織、子宮輸卵管、卵巢腫瘤及對(duì)側(cè)卵巢、肺、心臟)并固定備用。 ELISA檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組血清中CA125的水平。提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織總RNA, RT-PCR檢測(cè)兩組腫瘤組織內(nèi)與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或細(xì)胞死亡有關(guān)(CDKN1A、CDKN1B、FOXO1、CHEK2)的基因表達(dá)水平。 5.Anti-miR-182對(duì)卵巢腫瘤侵襲遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的影響 IVIS技術(shù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組原發(fā)瘤的轉(zhuǎn)移信號(hào)。對(duì)兩組動(dòng)物所有器官進(jìn)行組織切片和HE染色,顯微鏡下觀察個(gè)臟器轉(zhuǎn)移瘤的情況并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 6.腫瘤組織的分子生物學(xué)水平分析 提取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腫瘤及血清中的總RNA, RT和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腫瘤即血清中miR-182及其同一基因簇miR-183和miR-96的基因表達(dá)。提取兩組動(dòng)物腫瘤組織內(nèi)的總蛋白,Western blot檢測(cè)兩組腫瘤組織內(nèi)miR-182靶基因(BRCA1、MTSS1、FOX03)和誘導(dǎo)基因HMGA2的蛋白水平變化。 7. Anti-miR-182治療對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響 對(duì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織切片和HE染色,鏡下觀察腫瘤與卵巢、輸卵管和卵巢周圍脂肪組織的關(guān)系,免疫組織化學(xué)染色確定腫瘤周圍微環(huán)境中的細(xì)胞成分。炎癥基因芯片技術(shù)觀察兩組腫瘤組織內(nèi)炎癥基因譜的變化。RT-PCR檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(各8例)腫瘤內(nèi)趨化因子和細(xì)胞因子(CCL2、IL-6、IL-8、TNF-α、 IFN-γ)的基因水平變化。 人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3分為Control組、anti-miR-182組、miR-182過表達(dá)組、miR-182過表達(dá)+anti-miR-182組,37℃培養(yǎng)48小時(shí)后RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CCL2基因水平的變化。 8.藥物毒性分析 8周治療結(jié)束后,收集對(duì)照組和anti-miR-182實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的全部器官(肝臟、胰腺、胃腸道、腎、脾及子宮)并進(jìn)行組織切片和HE染色,鏡下觀察兩組組織內(nèi)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,判斷藥物的毒性作用。 研究結(jié)果 1. Anti-miR-182抑制體外卵巢癌細(xì)胞的增殖、基質(zhì)膠侵襲和轉(zhuǎn)化能力 RT-PCR結(jié)果顯示anti-miR-182顯著抑制OVCAR3、HEY-miR-182和SKOV3-miR-182細(xì)胞內(nèi)miR-182的基因水平(P0.001)。Western blot結(jié)果顯示,anti-miR-182顯著上調(diào)SKOV3-miR-182細(xì)胞內(nèi)miR-182靶基因FOXO3(1.47±0.18倍,P0.05)、BRCAl (3.09±0.99倍,P0.05)、和MTSS1(1.39±0.18倍,P0.05)的蛋白水平,同時(shí)下調(diào)miR-182誘導(dǎo)的HMGA2(62.6%±17.2%,P0.01)的蛋白表達(dá),對(duì)OVCAR3和HEY-miR-182細(xì)胞具有相似效應(yīng)。 基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示anti-miR-182可顯著抑制SKOV3-miR-182細(xì)胞的侵襲能力(抑制率57.1%±7.9%,P0.001)。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)表明anti-miR-182可顯著減少單細(xì)胞克隆形成數(shù)目和大小(抑制率54.8%±16.3%,P0.01)。WST-1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示anti-miR-182抑制SKOV3-miR-182細(xì)胞的體外增殖(第3天,P0.05；第四天P0.05；第五天P0.01)。 2.構(gòu)建裸鼠原位人卵巢癌模型 將SKOV3-miR-182-luc細(xì)胞包埋入Ⅳ型膠原并植入裸鼠左側(cè)卵巢包膜內(nèi),術(shù)后第二天,IVIS檢測(cè)結(jié)果表明所有小鼠熒光信號(hào)相同(相對(duì)熒光強(qiáng)度3-3.5x109),表明卵巢癌細(xì)胞植入量在所有動(dòng)物體內(nèi)基本一致,無腹腔泄漏。 3. Anti-miR-182治療抑制卵巢癌腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng) 術(shù)后第3天,小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組和anti-miR-182實(shí)驗(yàn)組并分別給予安慰劑或anti-miR-182腹腔注射治療,治療劑量25mg/kg,一周兩次,整個(gè)療程為8周。IVIS圖像顯示從治療第5周開始,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組腫瘤大小之間開始出現(xiàn)差異(對(duì)照組信號(hào)強(qiáng)度為(17.73±7.72)×109,實(shí)驗(yàn)組信號(hào)強(qiáng)度為(5.20±6.63)×109,P0.01),且該差異隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)而增大。 處死小鼠測(cè)量?jī)山M小鼠卵巢腫瘤實(shí)際大小發(fā)現(xiàn)表明anti-miR-182治療組的腫瘤(5.42±1.00mm,90.59±37.31mm3)顯著小于對(duì)照組(8.07±1.74mm,310.89±187.12mm3),其最長(zhǎng)徑線較對(duì)照組減少38%,體積較對(duì)照組減少70.9%(P0.01). ELISA結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠血清CA125水平高于實(shí)驗(yàn)組小鼠(P=0.06)。 RT-實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,mti-miR-182顯著上調(diào)腫瘤組織內(nèi)與細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡有關(guān)的miR-182假定靶基因CDKN1A(P=0.0199)、CDKN1B(P=0.0156)、 FOXO1(P0.0001)、CHEK2(P0.0001)。 4. Anti-miR-182治療抑制小鼠體內(nèi)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 治療第8周IVIS圖像顯示,對(duì)照組腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率為28%(5/8),實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)移率為7%(1/15)。組織學(xué)分析結(jié)果顯示對(duì)照組77.8%(14/18)的動(dòng)物存在至少一處轉(zhuǎn)移癌灶,實(shí)驗(yàn)組33.3%(5/15)的動(dòng)物存在至少一處轉(zhuǎn)移灶；對(duì)照組共發(fā)現(xiàn)31個(gè)轉(zhuǎn)移瘤,實(shí)驗(yàn)組僅發(fā)現(xiàn)6個(gè)轉(zhuǎn)移瘤。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目由多到少的部位是依次是脾臟(對(duì)照組陽(yáng)性率為44%,8/18；實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性率為20%,3/15)、大網(wǎng)膜(對(duì)照組陽(yáng)性率為28%,5/18；實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性率為13%,2/15)、胰腺(對(duì)照組陽(yáng)性率為22%,4/18；實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性率為0%)、和肝臟(對(duì)照組陽(yáng)性率為11%,2/18；實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性率為0%)。與其他部位的轉(zhuǎn)移瘤相比,胰腺轉(zhuǎn)移瘤更大、侵襲性更強(qiáng)。對(duì)照組有一只小鼠發(fā)生了對(duì)側(cè)卵巢轉(zhuǎn)移。雖然腎實(shí)質(zhì)內(nèi)未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤,對(duì)照組50%(9/18)的動(dòng)物的卵巢腫瘤與同側(cè)發(fā)生腎粘連,而anti-miR-182治療組動(dòng)物未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象(0/15)。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均未發(fā)現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移灶。 5. Anti-miR-182治療后腫瘤組織的分子生物學(xué)分析 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示與對(duì)照組腫瘤相比,anti-miR-182治療組的腫瘤組織內(nèi)miR-182表達(dá)水平極低(降低94.9%±13.3%)或低于測(cè)量范圍(P0.001),同時(shí)顯著降低miR-183的表達(dá)(降低92.5%0±9.7%,P0.001),但對(duì)miR-96的表達(dá)無影響(P0.05)。小鼠血清內(nèi)miR-182(降低53.2%±10.4%,P0.01)和miR-183(降低84.3%±20.6%,P0.01)的水平也顯著降低。 Western blot結(jié)果顯示經(jīng)anti-miR-182治療后腫瘤內(nèi)miR-182的靶基因BRCA1(2.63±0.35倍,P0.01)、FOXO3(1.4±0.18倍,P0.01)和MTSS1(2.63±1.29倍,P0.01)與對(duì)照組相比顯著上調(diào),而miR-182誘導(dǎo)的基因HMGA2表達(dá)下調(diào)(降低71.5%±4.0%,P0.01)。 6. Anti-miR-182治療誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制腫瘤的侵襲 組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)anti-miR-182治療組73.3%(11/15)的小鼠腫瘤細(xì)胞植入部位(卵巢旁軟組織)有大量單核細(xì)胞浸潤(rùn),對(duì)照組雖有16.7%(3/18)的動(dòng)物存在單核細(xì)胞浸潤(rùn),但單核細(xì)胞數(shù)量明顯少于實(shí)驗(yàn)組。免疫組織化學(xué)染色證實(shí)了浸潤(rùn)細(xì)胞為KP1陽(yáng)性小鼠單核細(xì)胞。單核細(xì)胞浸潤(rùn)少的腫瘤表現(xiàn)出浸潤(rùn)生長(zhǎng)模式,并穿透卵巢包膜侵入周圍脂肪組織,而周圍有大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)的腫瘤則局限于卵巢包膜內(nèi)。 炎癥基因譜分析顯示對(duì)照組腫瘤與anti-miR-182治療組腫瘤組織炎癥基因譜發(fā)生改變。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織內(nèi)CCL2(P0.0001). IL-6(P=0.0019)、IL-8(P=0.0002)、TNF-α (P=0.0088)、IFN-γ(P0.0001)的表達(dá)顯著上調(diào)。體外實(shí)驗(yàn)表明,無論在初始SKOV3細(xì)胞還是SKOV3-miR-182細(xì)胞,anti-miR-182均可顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)CCL2的基因表達(dá)(SKOV3細(xì)胞：3.6±0.73倍,P0.001；SKOV3-miR-182細(xì)胞：11.39±0.21倍,P0.001)。 7.Anti-miR-182治療對(duì)小鼠無明顯不良組織毒性作用 組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)8周anti-miR-182治療后,小鼠的肝臟、胰腺、胃腸道、腎、脾及子宮均無顯著的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)變化。 結(jié)論 1.建立的裸鼠原位卵巢癌模型可成功模擬人原發(fā)性卵巢癌的生長(zhǎng)和侵襲模式,適用于卵巢癌的體內(nèi)研究。 2.Anti-miR-182體內(nèi)、體外均可通過下調(diào)miR-182、恢復(fù)其靶分子的表達(dá)有效抑制人卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；同時(shí)anti-miR-182可誘導(dǎo)腫瘤局部炎癥反應(yīng)抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。 3. Anti-miR-182體內(nèi)應(yīng)用無不良組織學(xué)毒性作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

【共引文獻(xiàn)】

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3 田，

本文編號(hào)：2470707