【摘要】：第一部分SNAI2與卵巢癌臨床病理因素的相關(guān)性及其與預(yù)后的關(guān)系目的：探討SNAI2與卵巢癌臨床病理因素的相關(guān)性及其與預(yù)后的關(guān)系方法：從TCGA數(shù)據(jù)庫提取208例漿液性卵巢癌患者的臨床資料和SNAI2的表達數(shù)據(jù),卡法檢驗分析SNAI2的表達與年齡、組織學(xué)分級、FIGO分期和淋巴管浸潤的相關(guān)性；同時提取TCGA數(shù)據(jù)庫208例漿液性卵巢癌患者和GSE26712數(shù)據(jù)集185例漿液性卵巢癌患者的生存資料和SNAI2的表達數(shù)據(jù),Log-rank分析分析SNAI2的表達與卵巢癌患者總生存期的相關(guān)性,Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖。結(jié)果：SNAI2的表達和患者年齡及卵巢癌組織學(xué)分級無明顯相關(guān)性；SNAI2在FIGO III-IV期卵巢癌組織中的表達明顯高于FIGO I-II期卵巢癌組織中的表達,且SNAI2高表達的卵巢癌患者更容易發(fā)生淋巴管浸潤。在TCGA數(shù)據(jù)集中,SNAI2高表達的卵巢癌患者總生存期明顯低于SNAI2氐表達的卵巢癌患者(P=0.044,HR=0.65)。這一結(jié)果在GSE26712數(shù)據(jù)集中得到進一步確認,即SNAI2的表達與卵巢癌患者的總生存期呈明顯負相關(guān)(P=0.0017,HR=0.56)結(jié)論：SNAI2高表達是卵巢癌患者預(yù)后的一個不良因素。第二部分SNAI2相關(guān)ceRNA的篩選和鑒定目的：SNAI2相關(guān)ceRNA的篩選和鑒定方法：生物信息學(xué)預(yù)測并結(jié)合文獻篩選SNAI2相關(guān)ceRNA;在OVCA433和SKOV-3細胞中過表達SNAI2-3'UTR, Real-time PCR和Western Blot檢測干擾SNAI2-3'UTR前后候選基因表達水平的改變；選取受SNAI2-3'UTR正向調(diào)控的基因,在TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫檢測SNAI2和候選ceRNA在卵巢癌組織中的表達的相關(guān)性；Real-time PCR檢測能同時靶向SNAI2和MARCKS的miR-200c,miR-204, miR-211, miR-218和miR-429在OVCA433和SKOV-3細胞中的相對表達量,選取表達量相對較高的miRNA作為候選miRNA。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灧治龊蜻xmiRNA對MARCKS的抑制作用,以及SNAI2-3'UTR是否可以通過競爭性結(jié)合候選miRNA誘導(dǎo)MARCKS的表達。結(jié)果：生物信息學(xué)預(yù)測并結(jié)合文獻篩選出10個SNAI2相關(guān)ceRNA,包括CDH2, FN1, KLF8, MARCKS, MMP2, PPARG, TWIST1, VIM, ZEB1和ZEB2。在OVCA433和SKOV-3細胞中過表達SNAI2-3'UTR能顯著促進MARCKS的mRNA和蛋白表達水平。相關(guān)性分析進一步發(fā)現(xiàn),SNAI2和MARCKS在卵巢癌組織中的表達呈明顯正相關(guān)。且在SNAI2低表達的卵巢癌組織中,MARCKS也呈低表達,而在SNAI2高表達的卵巢癌組織中,MARCKS也呈高表達。miRNA表達譜分析表明,miR-218, miR-200c和miR-429在OVCA433和SKOV-3細胞中的表達量相對較高,miR-204表達相對較低,miR-211基本不表達。我們選取miR-218, miR-200c和miR-429作為候選miRNA。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鳎孩賛iR-218和miR-200c通過結(jié)合MARCKS-3'UTR種子區(qū)結(jié)合序列,顯著抑制熒光素酶的相對活性,而miR-429對熒光素酶抑制作用相對較弱；②SNAI2-3'UTR可以通過競爭性結(jié)合miR-218和miR-200c,抑制miR-218和miR-200c的活性,逆轉(zhuǎn)其對熒光素酶的抑制作用。結(jié)論：SNAI2作為ceRNA誘導(dǎo)的MARCKS表達增強至少部分是通過抑制miR-218和miR-200c活性介導(dǎo)的。第三部分MARCKS在卵巢癌EMT中的功能分析目的：解析MARCKS在卵巢癌EMT中的作用方法：用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA轉(zhuǎn)染OVCA433和SKOV-3細胞,構(gòu)建MARCKS穩(wěn)定低表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株,Real-time PCR和Western Blot檢測MARCKS降表達效率。羅氏實時細胞分析儀RTCA-CIM-Plate檢測MARCKS降表達后,卵巢癌OVCA433和SKOV-3細胞浸潤和遷移能力的改變；同時在顯微鏡下觀測干擾MARCKS表達前后,細胞形態(tài)學(xué)的改變。結(jié)果：在OVCA433和SKOV-3細胞中轉(zhuǎn)染MARCKS-shRNA后,MARCKS的mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)。功能學(xué)研究表明,下調(diào)MARCKS的表達能顯著抑制卵巢癌細胞的浸潤和遷移能力,同時細胞的形態(tài)更趨向于上皮細胞。結(jié)論：SNAI2促進卵巢癌細胞發(fā)生EMT的功能至少部分是通過ceRNA作用模式,誘導(dǎo)MARCKS表達介導(dǎo)。第四部分SNAI2-3'UTR在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用研究目的：探討SNAI2-3'UTR在卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。方法：用慢病毒載體在OVCA433和SKOV-3細胞中過表達SNAI2-3'UTR,羅氏實時細胞分析儀RTCA-CIM-Plate檢測干擾SNAI2-3'UTR前后卵巢癌細胞浸潤和遷移能力的改變。結(jié)果：在OVCA433和SKOV-3細胞中過表達SNAI2-3'UTR后,細胞的浸潤能力明顯得到增強,其遷移能力則無明顯改變。結(jié)論：SNAI2-3'UTR能顯著促進卵巢癌細胞的浸潤能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

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本文編號：2441105