發(fā)布時(shí)間：2019-01-30 20:34

【摘要】：目的 宮頸癌是嚴(yán)重危害全球女性健康的第二大婦科腫瘤，高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染是其主要的危險(xiǎn)因素，但并非唯一因素。研究發(fā)現(xiàn)，葉酸受體（FR）在多種腫瘤中表達(dá)異常，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究表明，F(xiàn)R在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)，但具體的作用機(jī)制還未見報(bào)道。本研究選擇從Src到細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子ERK信號通路中的關(guān)鍵因子Src、ERK1/2、c-Fos和c-Jun為靶點(diǎn)，檢測宮頸癌細(xì)胞中FR對其表達(dá)和功能變化的影響，探討FR介導(dǎo)ERK信號通路對宮頸癌產(chǎn)生的作用及其機(jī)制。 方法 采用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）篩選FR陽性細(xì)胞的基礎(chǔ)上，以FR陽性率最高的Hela細(xì)胞和FR陽性率最低的C33A細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，并對FR陽性率最高的Hela細(xì)胞進(jìn)行FR siRNA干擾。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測各組宮頸癌細(xì)胞的生長情況，CCK-8法檢測各組細(xì)胞的細(xì)胞活性，流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的增殖、凋亡情況及FR的表達(dá)水平，Real-time PCR檢測各組細(xì)胞FR、Src、ERK1/2、c-Fos和c-Jun mRNA的表達(dá)水平，Western-blot法檢測各組細(xì)胞Src、ERK1/2、c-Fos和c-Jun蛋白表達(dá)水平。采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入和分析，服從正態(tài)分布且方差齊性資料采用ANOVA和Dunnett-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Welch檢驗(yàn)，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)，兩種細(xì)胞間分析比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。 結(jié)果 1.不同宮頸癌細(xì)胞一般生物學(xué)性狀比較：（1）Hela和C33A細(xì)胞計(jì)數(shù)在24h時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），在48h、72h、96h和120h各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Hela細(xì)胞數(shù)均多于C33A細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）Hela細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）和處于S期、G2/M期細(xì)胞比例均高于C33A細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率和處于G0/G1期細(xì)胞比例均低于C33A細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 2.不同宮頸癌細(xì)胞ERK信號通路各相關(guān)因子表達(dá)的比較：（1）Hela細(xì)胞Src、ERK1和c-Jun mRNA相對表達(dá)量均明顯低于C33A細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而Hela和C33A細(xì)胞的ERK2和c-Fos mRNA相對表達(dá)量差異則均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。（2）C33A細(xì)胞p-Src、非磷酸化ERK1/2、p-c-Fos、非磷酸化c-Jun和p-c-Jun蛋白表達(dá)水平均低于Hela細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而Hela和C33A細(xì)胞非磷酸化Src、p-ERK1/2和非磷酸化c-Fos蛋白表達(dá)水平差異則均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 3.FR對宮頸癌細(xì)胞一般生物學(xué)性狀的影響：（1）隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長，F(xiàn)R干擾組細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.05），而對照組和陰性片段轉(zhuǎn)染組隨著時(shí)間延長，細(xì)胞活性逐漸增加。（2）FR干擾組細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）降低，處于G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期與G2/M期細(xì)胞比例下降，凋亡率升高。 4. FR對宮頸癌細(xì)胞ERK信號通路各相關(guān)因子表達(dá)的影響：（1）FR干擾后，Src、ERK1、ERK2和c-Jun mRNA相對表達(dá)量均增加，而c-Fos mRNA表達(dá)水平差異無明顯變化（P0.05）。（2）FR干擾后，p-Src蛋白表達(dá)水平升高，p-ERK1/2和p-c-Fos蛋白表達(dá)水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而非磷酸化Src、非磷酸化ERK1/2、非磷酸化c-Fos、非磷酸化c-Jun和p-c-Jun蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 結(jié)論 1.下調(diào)FR后，宮頸癌Hela細(xì)胞的活性下降，細(xì)胞凋亡率升高，處于G0/G1期細(xì)胞比例增多，Src、ERK1/2和c-Jun因子的mRNA表達(dá)水平以及p-Src蛋白表達(dá)水平均上調(diào)，而p-ERK1/2、c-Fos和p-c-Fos蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，提示，F(xiàn)R可上調(diào)ERK信號通路中的關(guān)鍵因子ERK1/2、c-Fos和c-Jun的蛋白表達(dá)，促進(jìn)其磷酸化。mRNA表達(dá)水平升高提示FR下調(diào)作用的靶點(diǎn)可能在蛋白翻譯和修飾水平，導(dǎo)致蛋白表達(dá)水平下調(diào)，而同時(shí)可能存在負(fù)反饋?zhàn)饔�，�?dǎo)致相應(yīng)指標(biāo)mRNA水平升高。 2. FR可下調(diào)宮頸癌Hela細(xì)胞ERK上游因子Src mRNA和蛋白的表達(dá)，提示FR在對ERK信號通路的激活中可能存在其他的中間因子，而轉(zhuǎn)染后Src的上調(diào)，，可能與ERK信號通路中被激活因子的負(fù)反饋調(diào)節(jié)有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。 3. FR可通過調(diào)節(jié)ERK信號通路中關(guān)鍵因子Src、ERK1/2、c-Jun和c-Fos的蛋白表達(dá)，可促進(jìn)宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期各時(shí)相比例。同時(shí)，本研究結(jié)果提示，F(xiàn)R可作為宮頸癌靶向治療的潛在載體。 4. FR和HPV雙陽性宮頸癌細(xì)胞較FR和HPV雙陰性宮頸癌細(xì)胞細(xì)胞增殖快，細(xì)胞凋亡率低，處于G0/G1期細(xì)胞比例低，ERK信號通路各因子mRNA的表達(dá)水平低，蛋白表達(dá)水平高。提示FR與HPV感染對ERK信號通路中關(guān)鍵因子的表達(dá)均有調(diào)節(jié)作用，且在宮頸癌的發(fā)生與進(jìn)展中可能存在協(xié)同作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

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本文編號：2418482