【摘要】：目的 宮頸癌是嚴重危害全球女性健康的第二大婦科腫瘤，高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）感染是其主要的危險因素，但并非唯一因素。研究發(fā)現(xiàn)，葉酸受體（FR）在多種腫瘤中表達異常，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。已有研究表明，F(xiàn)R在宮頸癌細胞中高表達，但具體的作用機制還未見報道。本研究選擇從Src到細胞內核轉錄因子ERK信號通路中的關鍵因子Src、ERK1/2、c-Fos和c-Jun為靶點，檢測宮頸癌細胞中FR對其表達和功能變化的影響，探討FR介導ERK信號通路對宮頸癌產(chǎn)生的作用及其機制。 方法 采用流式細胞術（FCM）篩選FR陽性細胞的基礎上，以FR陽性率最高的Hela細胞和FR陽性率最低的C33A細胞為實驗對象，并對FR陽性率最高的Hela細胞進行FR siRNA干擾。采用細胞計數(shù)檢測各組宮頸癌細胞的生長情況，CCK-8法檢測各組細胞的細胞活性，流式細胞儀分析各組細胞的增殖、凋亡情況及FR的表達水平，Real-time PCR檢測各組細胞FR、Src、ERK1/2、c-Fos和c-Jun mRNA的表達水平，Western-blot法檢測各組細胞Src、ERK1/2、c-Fos和c-Jun蛋白表達水平。采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行錄入和分析，服從正態(tài)分布且方差齊性資料采用ANOVA和Dunnett-t檢驗，方差不齊時采用Welch檢驗，組間兩兩比較使用LSD-t檢驗，兩種細胞間分析比較采用兩獨立樣本t檢驗。 結果 1.不同宮頸癌細胞一般生物學性狀比較：（1）Hela和C33A細胞計數(shù)在24h時差異無統(tǒng)計學意義（P0.05），在48h、72h、96h和120h各個時間點Hela細胞數(shù)均多于C33A細胞數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（2）Hela細胞增殖指數(shù)（PI）和處于S期、G2/M期細胞比例均高于C33A細胞，細胞凋亡率和處于G0/G1期細胞比例均低于C33A細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。 2.不同宮頸癌細胞ERK信號通路各相關因子表達的比較：（1）Hela細胞Src、ERK1和c-Jun mRNA相對表達量均明顯低于C33A細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而Hela和C33A細胞的ERK2和c-Fos mRNA相對表達量差異則均無統(tǒng)計學意義（P0.05）。（2）C33A細胞p-Src、非磷酸化ERK1/2、p-c-Fos、非磷酸化c-Jun和p-c-Jun蛋白表達水平均低于Hela細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而Hela和C33A細胞非磷酸化Src、p-ERK1/2和非磷酸化c-Fos蛋白表達水平差異則均無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 3.FR對宮頸癌細胞一般生物學性狀的影響：（1）隨著轉染時間的延長，F(xiàn)R干擾組細胞活性明顯降低（P＜0.05），而對照組和陰性片段轉染組隨著時間延長，細胞活性逐漸增加。（2）FR干擾組細胞增殖指數(shù)（PI）降低，處于G0/G1期細胞比例增加，S期與G2/M期細胞比例下降，凋亡率升高。 4. FR對宮頸癌細胞ERK信號通路各相關因子表達的影響：（1）FR干擾后，Src、ERK1、ERK2和c-Jun mRNA相對表達量均增加，而c-Fos mRNA表達水平差異無明顯變化（P0.05）。（2）FR干擾后，p-Src蛋白表達水平升高，p-ERK1/2和p-c-Fos蛋白表達水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而非磷酸化Src、非磷酸化ERK1/2、非磷酸化c-Fos、非磷酸化c-Jun和p-c-Jun蛋白表達水平差異均無統(tǒng)計學意義（P0.05）。 結論 1.下調FR后，宮頸癌Hela細胞的活性下降，細胞凋亡率升高，處于G0/G1期細胞比例增多，Src、ERK1/2和c-Jun因子的mRNA表達水平以及p-Src蛋白表達水平均上調，而p-ERK1/2、c-Fos和p-c-Fos蛋白表達水平均下調，提示，F(xiàn)R可上調ERK信號通路中的關鍵因子ERK1/2、c-Fos和c-Jun的蛋白表達，促進其磷酸化。mRNA表達水平升高提示FR下調作用的靶點可能在蛋白翻譯和修飾水平，導致蛋白表達水平下調，而同時可能存在負反饋作用，導致相應指標mRNA水平升高。 2. FR可下調宮頸癌Hela細胞ERK上游因子Src mRNA和蛋白的表達，提示FR在對ERK信號通路的激活中可能存在其他的中間因子，而轉染后Src的上調，，可能與ERK信號通路中被激活因子的負反饋調節(jié)有關，具體機制還需進一步研究。 3. FR可通過調節(jié)ERK信號通路中關鍵因子Src、ERK1/2、c-Jun和c-Fos的蛋白表達，可促進宮頸癌Hela細胞的增殖、抑制細胞凋亡和調節(jié)細胞周期各時相比例。同時，本研究結果提示，F(xiàn)R可作為宮頸癌靶向治療的潛在載體。 4. FR和HPV雙陽性宮頸癌細胞較FR和HPV雙陰性宮頸癌細胞細胞增殖快，細胞凋亡率低，處于G0/G1期細胞比例低，ERK信號通路各因子mRNA的表達水平低，蛋白表達水平高。提示FR與HPV感染對ERK信號通路中關鍵因子的表達均有調節(jié)作用，且在宮頸癌的發(fā)生與進展中可能存在協(xié)同作用。
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【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.33

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本文編號：2418482