【摘要】：研究背景 卵巢癌(ovarian cancer, OCa)是女性生殖器官腫瘤中常見(jiàn)的惡性腫瘤,其死亡率在婦科惡性腫瘤高居于首位。卵巢癌發(fā)病隱匿,大于2/3的患者出現(xiàn)癥狀時(shí)已經(jīng)屬于晚期。腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以鉑類化療藥物為主的聯(lián)合化療是晚期卵巢癌的主要治療策略,可暫時(shí)緩解病情,然而70%的患者在3年內(nèi)復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)后的卵巢癌耐藥性增強(qiáng),惡性程度增加,嚴(yán)重影響患者的預(yù)后及生存質(zhì)量,使患者5年生存率大大下降。因此,探討EOC的分子發(fā)病機(jī)制,尋找新型的和選擇性強(qiáng)的抗卵巢癌藥物,提高化療敏感性或逆轉(zhuǎn)耐藥,對(duì)指導(dǎo)卵巢癌治療具有重要意義。新型抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)主要集中在以下兩方面：(1)針對(duì)OCa的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,探尋新分子作用靶點(diǎn)；(2)從天然產(chǎn)物(植物、海洋生物等)中尋找新的活性成分。 MicroRNA(簡(jiǎn)稱1miRNA)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類長(zhǎng)約22nt內(nèi)源性非編碼的小RNA分子,主要通過(guò)靶向到mRNA的3'UTR進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá),引起靶mRNA降解或蛋白翻譯的抑制。研究發(fā)現(xiàn),miRNA參與了多種生命活動(dòng),包括個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖和代謝等。miRNA的表達(dá)具有組織特異性；在多腫瘤組織中往往表達(dá)失調(diào),與包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、耐藥等病理進(jìn)程密切相關(guān),對(duì)腫瘤的診斷、治療和判斷預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。約有半數(shù)的miRNA基因位于腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)或脆性位點(diǎn),通過(guò)調(diào)控體內(nèi)相應(yīng)的癌基因或抑癌基因的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮重要的致癌或抑癌因子的功能。與正常卵巢組織相比,卵巢癌組織有特異的miRNA表達(dá)譜。文獻(xiàn)顯示miR-519d在晚期卵巢癌中表達(dá)下調(diào),但下調(diào)機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。而且,miRNA通過(guò)影響細(xì)胞凋亡或相關(guān)信號(hào)通路參與卵巢癌化療耐藥的形成。因此,恢復(fù)失衡的miRNA的表達(dá)已經(jīng)成為一個(gè)嶄新的、有發(fā)展前景的巢癌治療的新方向。 天然藥物是人類防病治病、藥物研發(fā)的重要源泉。如卵巢癌一線化療藥物紫杉醇即為從紅豆杉屬植物中分離純化得到的一類二萜類化合物。其抗癌機(jī)制主要為促進(jìn)微管聚合、穩(wěn)定微管,阻斷正常的有絲分裂,發(fā)揮治療卵巢癌的作用。大多數(shù)卵巢癌患者治療效果較好,但20%以上的患者對(duì)紫杉醇耐藥。因此,新型的天然抗腫瘤藥物的尋找又成為熱點(diǎn)。雙聯(lián)芐類化合物是從苔蘚類植物中提取并分離得到的一類大環(huán)多酚類化合物,具廣泛的生物學(xué)活性,如抗炎、抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤等,是一類發(fā)展前景良好的抗癌新藥。Dihydroptychantol (DHA)是雙聯(lián)芐化合物的一種,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),其在多種腫瘤細(xì)胞株中可顯著抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡；DHA還可誘導(dǎo)其他類型的細(xì)胞死亡,如自噬性死亡。然而,雙聯(lián)芐化合物的抗卵巢癌活性未有報(bào)道,其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。 第一部分：miR-519d通過(guò)靶向調(diào)控XIAP抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及增強(qiáng)順鉑敏感性的研究 研究目的： 檢測(cè)miR-519d在卵巢癌細(xì)胞系和組織中的表達(dá),探討其對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響和與順鉑敏感性的關(guān)系。通過(guò)預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-519d靶基因,揭示miR-519d的作用機(jī)制。 材料方法： 應(yīng)用TaqMan探針?lè)z測(cè)卵巢癌細(xì)胞系(OVCAR3、SKOV3及A2780)上皮性卵巢癌組織及正常卵巢組織的miR-519d的表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR-519d mimics或inhibitors實(shí)現(xiàn)miR-519d在卵巢癌細(xì)胞的上調(diào)或下調(diào),采用MTT法檢測(cè)對(duì)卵巢癌細(xì)胞的增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-519d的靶基因,構(gòu)建雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miR-519d與靶基因XIAP的關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1. miR-519d在卵巢癌細(xì)胞系及卵巢癌組織中的表達(dá)情況 應(yīng)用TaqMan探針實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞系(OVCAR3、 SKOV3及A2780)及上皮性卵巢癌組織7例和正常卵巢組織2例中的1miR-519d的表達(dá)。結(jié)果顯示：卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3、SKOV3及A2780中miR-519d的表達(dá)水平顯著低于正常卵巢組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。上皮性卵巢癌7例組織中miR-519d的表達(dá)均較正常組織明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。 2.轉(zhuǎn)染miR-519d對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響 在A2780及SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-519d mimics及inhibitors48h后,應(yīng)用TaqMan探針qRT-PCR法檢測(cè)miR-519d的表達(dá)。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-519d mimics48h后,A2780及SKOV3細(xì)胞內(nèi)的miR-519表達(dá)明顯上調(diào),分別為對(duì)照組的3985.33±400.05倍和2260.97±541.25倍。而轉(zhuǎn)染miR-519d inhibitors后,A2780及SKOV3細(xì)胞的miR-519d表達(dá)顯著被抑制,分別是對(duì)照組的0.32±0.07倍和0.08±0.02倍。在A2780及SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-519d mimics48h及72h后,應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測(cè)A2780及SKOV3細(xì)胞增殖能力。結(jié)果顯示：上調(diào)A2780細(xì)胞內(nèi)miR-519d水平后,48h及72h的A2780細(xì)胞增殖抑制率分別為：(15.50±3.62)%和(29.70±8.31)%,與對(duì)照相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.004及0.03)。上調(diào)SKOV3細(xì)胞內(nèi)的miR-519d水平對(duì)其增殖能力無(wú)明顯影響。 3.轉(zhuǎn)染miR-519d對(duì)卵巢癌細(xì)胞的順鉑敏感性的影響 3.1.轉(zhuǎn)染miR-519d對(duì)順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞增殖抑制作用的影響 在A2780及SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-519d mimics48h后,聯(lián)合應(yīng)用不同濃度梯度的順鉑(25,50,100μM)作用24h。應(yīng)用MTT法檢測(cè)A2780及SKOV3細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果顯示：順鉑25μM作用于A2780細(xì)胞24h后,miR-519d轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組的細(xì)胞增殖率分別為(27.01±1.65)%和(38.18±1.48)%(P0.05)；順鉑501μM作用時(shí),miR-519d轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組的A2780細(xì)胞增殖率分別為(19.40±1.46)%和(30.07±5.76)%(P0.05)；順鉑100μM作用時(shí),miR-519d轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組的A2780細(xì)胞增殖率分別為(13.38±1.34)%和(20.92±2.23)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。轉(zhuǎn)染miR-519d的SKOV3細(xì)胞經(jīng)順鉑作用后,細(xì)胞增殖率變化趨勢(shì)與A2780細(xì)胞一致。 3.2.轉(zhuǎn)染miR-519d對(duì)順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡作用的影響 在A2780及SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-519d mimics48h后,聯(lián)合應(yīng)用不同濃度的順鉑(25,50μM)作用24h,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A2780及SKOV3細(xì)胞的凋亡率,結(jié)果顯示：順鉑25μM作用于A2780細(xì)胞24h后,miR-519d轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組的晚期凋亡率分別為(60.72±3.59)%和(46.82±2.38)%(P0.05)。50μM順鉑作用時(shí),轉(zhuǎn)染1niR-519d組與陰性對(duì)照組的晚期凋亡率分別為(77.65±4.78)%和(67.26±5.35)%(P0.05)。對(duì)于SKOV3細(xì)胞,早期凋亡、晚期凋亡及壞死細(xì)胞均較對(duì)照組增加。應(yīng)用western blot法檢測(cè)A2780及SKOV3細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示：順鉑50μM作用于A2780和SKOV3細(xì)胞24h后,miR-519d轉(zhuǎn)染組的酶原形式Caspase-3表達(dá)均較對(duì)照組降低,而Caspase-3及其底物PARP的剪切形式較對(duì)照組增加,表明1miR-519d加速了細(xì)胞凋亡進(jìn)程。 4. miR-519d靶基因的預(yù)測(cè)及其在A2780和SKOV3細(xì)胞中的驗(yàn)證 TargetScan在線預(yù)測(cè)XIAP的3’UTR有兩個(gè)miR-519d的結(jié)合位點(diǎn),分別是1228-1234位點(diǎn)及4925-4931位點(diǎn)。在A2780及SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-519d mimics或inhibitors48h后,western blot法及qRT-PCR法分別檢測(cè)XIAP的蛋白及mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-519d mimics48h后,A2780及SKOV3細(xì)胞內(nèi)XIAP的蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照組的0.39±0.06倍和0.62±0.06倍(P值均小于0.05)；轉(zhuǎn)染miR-519d inhibitors48h后,A2780及SKOV3細(xì)胞內(nèi)XIAP的蛋白表達(dá)水平分別是對(duì)照組的1.32±0.03倍和1.29±0.02倍(P值均小于0.05); XIAP mRNA的表達(dá)與蛋白的表達(dá)趨勢(shì)完全一致。分別構(gòu)建含有Targetscan預(yù)測(cè)的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的XIAP3'UTR片段的雙熒光素酶表達(dá)載體,與miR-519d共轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞48h后,檢測(cè)相對(duì)熒光素酶的表達(dá)活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：野生型XIAP3'UTR (position1228-1234)雙熒光報(bào)告基因載體組的熒光素酶相對(duì)活性明顯低于突變型XIAP3'UTR組(89.28±15.83vs.167.37±21.34),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。構(gòu)建的4925-4931位點(diǎn)的熒光素報(bào)告載體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與1228-1234位點(diǎn)的相一致。 5. XIAP siRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖及順鉑敏感性的影響 5.1. XIAP siRNA在A2780及SKOV3細(xì)胞中干擾作用的驗(yàn)證 XIAP siRNA作用于A2780及SKOV3細(xì)胞48h后, western blot法檢測(cè)XIAP的蛋白表達(dá),結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染XIAP siRNA的A2780及SKOV3細(xì)胞內(nèi)XIAP蛋白的表達(dá)均為陰性。 5.2. XIAP siRNA對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響 在A2780及SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染XIAP siRNA48h和72h后,MTT法檢測(cè)A2780及SKOV3細(xì)胞增殖能力,結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染XIAP siRNA48h和72h后的A2780細(xì)胞增殖抑制率分別為(18.53±7.75)%和(24.84±3.70)%,與對(duì)照相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；XIAP siRNA對(duì)SKOV3細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯影響(P0.05)。 5.3. XIAP siRNA對(duì)順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡作用的影響 在A2780及SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染XIAP siRNA48h后,聯(lián)合應(yīng)用不同濃度的順鉑作用24h,應(yīng)用MTT法檢測(cè)卵巢癌A2780及SKOV3細(xì)胞的增殖能力,結(jié)果顯示：順鉑50μM作用于A2780細(xì)胞24h后,XIAP siRNA干擾組與陰性對(duì)照組的A2780細(xì)胞增殖率分別為(37.75±1.95)%和(49.57±2.26)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；順鉑100μM作用時(shí),XIAP siRNA干擾組與陰性對(duì)照組的A2780細(xì)胞增殖率分別(16.52±5.29)為和(31.02±1.0)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。轉(zhuǎn)染XIAP siRNA的SKOV3細(xì)胞經(jīng)順鉑作用后,細(xì)胞增殖率變化趨勢(shì)與A2780細(xì)胞一致。 在A2780及SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染XIAP siRNA48h后,聯(lián)合應(yīng)用不同濃度的順鉑作用24h,應(yīng)用western blot法檢測(cè)A2780和SKOV3細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示：順鉑50μM作用于A2780和SKoV3細(xì)胞24h后, XIAP siRNA干擾組的Caspase-3及其底物PARP的剪切形式增加。 6.卵巢癌細(xì)胞及組織中XIAP的表達(dá)情況 應(yīng)用TaqMan探針qRT-PCR法檢測(cè)OVCAR3、SKOV3及A2780細(xì)胞內(nèi)的miR-519d的表達(dá)情況,結(jié)果以2-ΔCT×103值表示,分別為1.572±0.033,1.474±0.026及0.299±0.007。應(yīng)用qRT-PCR法及western blot法分別檢測(cè)三株卵巢癌細(xì)胞系XIAP mRNA和蛋白水平的表達(dá),結(jié)果顯示：XIAP mRNA定量結(jié)果以2-ΔcT×103值表示分別為0.003±0.002,47.62±2.33及49.68±21.32,XIAP蛋白水平的表達(dá)趨勢(shì)與mRNA水平完全一致,表明XIAP的表達(dá)與miR-519d表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。應(yīng)用western blot法檢測(cè)7例上皮性卵巢癌組織與2例正常卵巢組織XIAP蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示：卵巢癌組織中XIAP蛋白表達(dá)水平與正常卵巢組織相比均顯著上調(diào),與miR-519d表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論： 1. miR-519d抑制卵巢癌SKOV3及A2780細(xì)胞增殖,增強(qiáng)其對(duì)順鉑作用的敏感性。 2. miR-519d通過(guò)調(diào)控XIAP表達(dá)發(fā)揮抑癌基因功能。 第二部分雙聯(lián)芐化合物DHA2通過(guò)調(diào)控XIAP及AKT/mTOR信-號(hào)-通路抑制卵巢癌作用機(jī)制的研究 研究目的： 檢測(cè)DHA2對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡和自噬的影響,探討其作用機(jī)制,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DHA2的抑瘤效果。 材料方法： DHA2作用于卵巢癌細(xì)胞后,MTT法檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞的增殖能力,western blot檢測(cè)細(xì)胞中凋亡、自噬相關(guān)蛋白及AKT/mTOR通路蛋白的表達(dá)變化,PI/Annexin V雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞死亡率,吖啶橙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)AVOs的形成,免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞中LC3的表達(dá),針對(duì)XIAP基因,設(shè)計(jì)并構(gòu)建XIAP真核表達(dá)質(zhì)粒,HE染色及免疫組化染色檢測(cè)裸鼠移植瘤的凋亡、自噬及增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.DHA及DHA1-3活性的細(xì)胞系篩選及其對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 應(yīng)用不同濃度的DHA及DHA1-3處理四種卵巢癌細(xì)胞系24h后,MTT法檢測(cè)四種卵巢癌細(xì)胞系的增殖。結(jié)果顯示：DHA及其衍生物DHA1-3對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、A2780、3A0和OVCAR3均有不同程度的增殖抑制作用,且呈劑量依賴性。DHA2對(duì)SKOV3,3AO和A2780細(xì)胞增殖的IC50值分別為13.44±0.84μmol/L,4.04±0.33μmol/L和19.80±1.08μmol/L, DHA2對(duì)正常視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞RPE1細(xì)胞則毒性很小,IC50值為471.72±94.02μmol/L。 2.DHA2誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞死亡的機(jī)制研究 2.1DHA2對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 不同濃度的DHA2作用于SKOV3細(xì)胞24h后,鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,結(jié)果顯示：在DHA25μM作用時(shí),細(xì)胞體積略增加,細(xì)胞質(zhì)密度增加；在DHA2作用時(shí),細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大小不等的空泡,細(xì)胞邊緣不規(guī)則；在DHA215μM時(shí),細(xì)胞變圓,皺縮,與鄰近細(xì)胞脫離。 2.2DHA2對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞死亡的影響 不同濃度的DHA2作用于SKOV3細(xì)胞24h后,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SKOV3細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示：DHA25μM,10μM和15μM誘導(dǎo)的SKOV3的細(xì)胞死亡率分別為25.01%,56.03%和58.44%。通過(guò)測(cè)定LDH的泄漏率來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷的程度,結(jié)果顯示：細(xì)胞內(nèi)的LDH釋放呈劑量依賴性增加,DHA215μM處理時(shí),LDH的泄漏率較對(duì)照增加4倍左右(904±97vs.238±12,P0.01)。應(yīng)用廣譜Caspase家族抑制劑z-VAD-fmk(20μM)或壞死性凋亡抑制劑necrostatin-1(30μM)預(yù)處理細(xì)胞2h后,加入12.5μM DHA2繼續(xù)作用12h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞死亡率。結(jié)果顯示：廣譜Caspase抑制劑z-VAD-fmk對(duì)DHA2誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞死亡無(wú)顯著逆轉(zhuǎn)作用(18.75±4.28%vs.14.04±2.74%)(P0.05)。應(yīng)用壞死抑制劑necrostatin-1對(duì)DHA2誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞死亡亦無(wú)明顯作用(23.18±1.86%vs.24.04±3.79%)(P0.05)。 2.3DHA2對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 不同濃度的DHA2(5,10,15pM)作用于SKOV3細(xì)胞24h后,western blot方法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：DHA2誘導(dǎo)的死亡伴隨著抗凋亡蛋白XIAP、Bcl-2的下調(diào),促凋亡蛋白Bax的上調(diào),Bcl-2/Bax比值下調(diào),呈時(shí)間和劑量依賴性；Caspase的底物PARP的剪切形式在SKOV3細(xì)胞中無(wú)明顯增加。 2.4. XIAP在DHA2誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞死亡的作用 構(gòu)建XIAP過(guò)表達(dá)載體,在SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染XIAP過(guò)表達(dá)載體24h后,繼續(xù)應(yīng)用12.5μMDHA2處理12h,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SKOV3細(xì)胞死亡率,結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)XIAP幾乎可完全逆轉(zhuǎn)DHA2誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞死亡(31.87±3.53%vs.7.44±4.37%)(P0.05)。設(shè)計(jì)XIAP siRNA,轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞48h后,繼續(xù)應(yīng)用12.5μM DHA2處理12h,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SKOV3細(xì)胞死亡率。結(jié)果顯示：干擾XIAP表達(dá)能顯著增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)DHA2的敏感性(20.41±6.98%vs.33.79±5.02%)(P0.05)。 3.DHA2對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬的影響 3.1.DHA2對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬溶酶體的作用 DHA212.5μM處理SKOV3細(xì)胞12h和24h,應(yīng)用AO染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)處理后SKOV3細(xì)胞內(nèi)的酸性自噬溶酶體空泡(AVOs)的形成。結(jié)果顯示：隨著DHA2作用時(shí)間的延長(zhǎng),AO染色的熒光強(qiáng)度明顯向右偏移,提示DHA2誘導(dǎo)細(xì)胞自噬體的形成。 3.2.DHA2對(duì)SKOV3細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)影響 DHA212.5μM處理SKOV3細(xì)胞不同時(shí)間后,應(yīng)用免疫熒光染色檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示：DHA2處理的SKOV3細(xì)胞自6h開(kāi)始于胞漿內(nèi)逐漸出現(xiàn)紅色熒光斑點(diǎn),隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),熒光斑點(diǎn)數(shù)量明顯增加,熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。不同濃度的DHA2(5,10,15μM)作用于SKOV3細(xì)胞24h,或者]2.5μMDHA2作用于SKOV3細(xì)胞不同時(shí)間后,應(yīng)用western blot法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示：DHA2在卵巢癌SKOV3細(xì)胞中以劑量依賴性及濃度依賴性的方式誘導(dǎo)LC3-II的表達(dá)上調(diào),同時(shí)促進(jìn)了LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化；自噬降解底物p62表達(dá)隨著藥物作用時(shí)間的增加逐漸降低；其他自噬相關(guān)蛋白如ATG5、Beclinl的表達(dá)變化不明顯。qRT-PCR法檢測(cè)自噬相關(guān)基因的mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示：經(jīng)DHA2作用后,自噬相關(guān)基因Atg5、Atg7、Atg12、 Beclinl等的mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化。 3.3.自噬抑制劑對(duì)DI-IA2誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞死亡的影響 應(yīng)用自噬抑制劑(E64D/Pepstatin A或氯喹)預(yù)處理SKOV3細(xì)胞2h后,再應(yīng)用DHA212.5μM處理SKOV3細(xì)胞12h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞死亡率。結(jié)果顯示：E64D/Pepstatin A聯(lián)合DHA2作用比DHA2單獨(dú)作用時(shí)細(xì)胞死亡率明顯增加(40.06±7.84%vs.27.93±2.31%,P0.05)；應(yīng)用氯喹阻斷自噬后也明顯增強(qiáng)DHA2介導(dǎo)的細(xì)胞死亡(40.06±7.84%vs.27.93±2.31%,P0.05)。在SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ATG5siRNA48h后,再應(yīng)用DHA212.5μM處理12h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞死亡率。結(jié)果顯示：應(yīng)用ATG5siRNA能有效阻斷LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化,并增強(qiáng)DHA2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。 4.DHA2誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞自噬的機(jī)制研究 4.1.DHA2對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路的影響 不同濃度的DHA2(5,10,15μM)作用于SKOV3細(xì)胞24h,或者12.5pM DHA2作用于SKOV3細(xì)胞不同時(shí)間后,western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中AKT/mTOR通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：15μM DHA2可明顯抑制p-AKT.p-mTOR的活性,而對(duì)AKT和mTOR總蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯影響。在作用時(shí)間上,DHA2作用3h即可引起p-AKT的明顯下調(diào),隨作用時(shí)間的延長(zhǎng),p-AKT的活性持續(xù)下調(diào)。對(duì)于p-mTOR, DHA2作用9h也出現(xiàn)顯著下調(diào)。 4.2. XIAP對(duì)DHA2誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞自噬的影響 XIAP siRNA處理SKOV3細(xì)胞48h后,應(yīng)用12.5μMDHA2繼續(xù)作用12h,應(yīng)用western blot法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染XIAP siRNA的SKOV3細(xì)胞中,LC3-II/-I值為陰性對(duì)照組的1.6倍。DHA2單獨(dú)作用的LC3-Ⅱ/-Ⅰ值為8.83,而敲除XIAP后使DHA2引起的LC3-Ⅱ/-Ⅰ值上調(diào)至12.24。 4.3.AKT在DHA2誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞死亡與自噬中的作用 在SKOV3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染AKTl-Myr載體48h后,應(yīng)用12.5μM DHA2繼續(xù)作用12h, western blot檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞死亡率。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染AKT1-Myr載體48h后,p-AKT的水平明顯上調(diào),并伴隨著LC3-II的表達(dá)下調(diào),而且能部分逆轉(zhuǎn)DHA2引起的細(xì)胞死亡(31.47±2.68%vs.12.34±3.05%,P0.01)。 應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理SKOV3細(xì)胞2h后,應(yīng)用12.5μMDHA2繼續(xù)作用12h, western blot檢測(cè)SKOV3細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV3細(xì)胞死亡率。結(jié)果顯示：LY294002可顯著降低p-AKT的活性,增加LC3-II的積累,并顯著增強(qiáng)DHA2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(17.53±2.62%vs.32.26±2.04%,P0.01)。 5.DHA2對(duì)SKOV3卵巢癌裸鼠移植瘤的影響 5.1.DI-IA2對(duì)SKOV3卵巢癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用 建立卵巢癌SKOV3細(xì)胞荷瘤裸鼠動(dòng)物模型,建模成功后隨機(jī)分為對(duì)照組、DHA2低濃度組(15mg/kg)和DHA2高濃度組(30mg/kg),隔日腹腔用藥,連續(xù)兩周。結(jié)果顯示：低劑量和高劑量DHA2均顯著地抑制腫瘤的生長(zhǎng),瘤塊體積和瘤重的減少較對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積繪制腫瘤的生長(zhǎng)曲線,結(jié)果顯示：DHA2給藥組能顯著地抑制腫瘤生長(zhǎng)；隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng),抑瘤效果更加明顯。低劑量組和高劑量組的腫瘤體積抑制率分別為48.76%和41.79%,兩劑量組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用western blot方法檢測(cè)了各組腫瘤組織中凋亡相關(guān)及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示：DHA2給藥組的腫瘤組織中XIAP的表達(dá)低于對(duì)照組,p-AKT、p-mTOR及LC3的表達(dá)變化與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)完全一致。 采用HE染色法對(duì)腫瘤組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征的觀察,結(jié)果顯示：DHA2抑制了腫瘤細(xì)胞的分化,并伴隨著局部腫瘤組織的壞死。應(yīng)用免疫組化檢測(cè)Ki67的表達(dá)情況,結(jié)果顯示：三組的Ki67比率分別為對(duì)照組(55.62±22.92)%,低劑量組(1.31±11.14)%,高劑量組(5.4±7.81)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01vs.對(duì)照組)。免疫組化結(jié)果顯示：DHA2給藥組中XIAP、p-AKT和p-mTOR表達(dá)較對(duì)照組降低,而LC3表達(dá)高于對(duì)照組。 5.2.DHA2對(duì)移植瘤模型的骨髓抑制作用及肝腎毒性研究 血常規(guī)結(jié)果顯示,各組間白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板的水平無(wú)明顯差異,提示DHA2對(duì)骨髓造血功能無(wú)明顯的抑制作用。對(duì)各組的肝、脾、腎器官進(jìn)行HE染色未發(fā)現(xiàn)有明顯的組織學(xué)異常改變。肝腎功能血液學(xué)結(jié)果顯示,高劑量組中的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平較對(duì)照組和低劑量組有所升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；各組間的血清肌酐(SCr)水平無(wú)明顯差異,而高劑量組中的尿素氮(BUN)水平比對(duì)照組和低劑量組有所升高(P0.05)。 結(jié)論： 1.DHA2在卵巢癌中具有生長(zhǎng)抑制作用。 2.AKT在DH_A2誘導(dǎo)的SKOV3細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要調(diào)控作用。 3.DHA2有可能成為治療卵巢癌的新型天然藥物。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳為;彭萍;;X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白和Caspase-3在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2010年07期

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本文編號(hào)：2415566