【摘要】：乙醇可影響大腦發(fā)育，孕期乙醇暴露可誘發(fā)新生兒神經(jīng)發(fā)育遲滯及精神發(fā)育障礙，是最主要的預(yù)測(cè)出生缺陷的因素之一。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)、滋養(yǎng)神經(jīng)元的作用，也是神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮免疫功能的細(xì)胞。血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)的存在使中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system, CNS）與外界的物質(zhì)交換受到了嚴(yán)格的限制。CNS的固有免疫反應(yīng)與多種神經(jīng)和精神性疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。TLR4（toll-like receptor4）是CNS固有免疫應(yīng)答識(shí)別抗原物質(zhì)的重要分子，目前對(duì)TLR4介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答通路的研究已較為廣泛和深入，但乙醇暴露對(duì)該通路是否存在影響仍無(wú)定論。本研究圍繞CNS TLR4介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)，分三個(gè)部分探討孕期乙醇暴露對(duì)新生兒CNS發(fā)育的影響。 第一部分：分別于新生大鼠（生后1,3,7,14,21天）側(cè)腦室（0.3mg/kg,1mg/ml）和腹腔內(nèi)（0.3mg/kg,1mg/ml）注射小劑量脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），12小時(shí)后以實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot檢測(cè)全腦中TLR4mRNA以及myeloiddifferentiation factor88(MyD88)，nuclear factor-kappa Bp50(NF-κBp50)蛋白的表達(dá)。并于新生大鼠（生后1,3,7天）腹腔和側(cè)腦室注射LPS（劑量同前），12小時(shí)后腦部切片行Iba-1和RECA雙標(biāo)的免疫熒光染色。伊文思藍(lán)（evans blue, EB）滲透實(shí)驗(yàn)觀察新生大鼠（生后1,3,7天）腹腔注射LPS（0.3mg/kg,0.01mg/ml）12小時(shí)后全腦切片是否有EB的滲出。透射電鏡觀察新生大鼠（生后1,3天）腹腔注射LPS （0.3mg/kg,0.01mg/ml）12小時(shí)后腦部超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果：即使在出生后1天內(nèi)，新生大鼠CNS也能對(duì)腦內(nèi)注射的LPS做出強(qiáng)烈反應(yīng)。TLR4mRNA以及MyD88，NF-κBp50蛋白的表達(dá)量顯著升高，Iba-1特異性標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，，并且激活的小膠質(zhì)細(xì)胞分布于腦內(nèi)各處，與RECA所標(biāo)記的毛細(xì)血管的位置無(wú)關(guān)。而腹腔內(nèi)小劑量注射LPS卻不能激活CNS TLR4介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)。腹腔內(nèi)小劑量注射LPS12小時(shí)后，掃描新生大鼠全腦各個(gè)層面均未發(fā)現(xiàn)有EB滲出的跡象，且腦內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)都基本正常。 第二部分：建立孕期乙醇暴露大鼠模型，3組孕鼠從受孕開(kāi)始整個(gè)孕期分別進(jìn)食酒精流體飼料，對(duì)照組流體飼料和普通固體飼料。從子代大鼠出生后第27天開(kāi)始對(duì)孕期乙醇暴露組與對(duì)照組子代大鼠腹腔注射Brdu（200mg/kg），連續(xù)注射3天，第四天（生后30天）免疫熒光染色檢測(cè)大鼠腦內(nèi)抗Brdu與Doublecortin表達(dá)情況。同時(shí)給予三組子代大鼠（生后30天）側(cè)腦室立體定位注射LPS（0.3mg/kg,1mg/ml）12小時(shí)后Western Blot檢測(cè)大鼠腦組織中9種蛋白（TLR4, MyD88, TRAF6, TRIF,NF-κBp50, pI-κB, TNFα, IL-1β, IFN）的表達(dá)量。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Western Blot的結(jié)果，我們做了TRAF6、TRIF分別與NF-κB雙標(biāo)的免疫熒光染色，觀察孕期乙醇暴露組與對(duì)照組子代大鼠在側(cè)腦室立體定位注射LPS前后這三種分子的表達(dá)情況的變化及分布。 結(jié)果：孕期乙醇暴露組與對(duì)照組子代大鼠（生后30天）Doublecortin標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)、數(shù)量與分布無(wú)明顯變化，與Brdu雙標(biāo)的新生成的神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量與分布也未觀察到到明顯變化。對(duì)照組子代大鼠在LPS刺激12小時(shí)后全腦中9種蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)；而孕期乙醇暴露組子代大鼠在LPS刺激12小時(shí)后全腦中TLR4,TRIF和IFN的表達(dá)水平與對(duì)照組相比降低，MyD88, TRAF6, NF-κBp50, pI-κB, TNFα和IL-1β的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。TLR4，MyD88，TRAF6，pI-κB和NF-κBp50的基礎(chǔ)表達(dá)量（未給予LPS刺激）在各組子代大鼠間沒(méi)有顯著差異，而TRIF，TNFα，IL-1β和IFN的表達(dá)量，孕期乙醇暴露組顯著高于對(duì)照組。免疫熒光染色結(jié)果顯示對(duì)照組30天子代大鼠側(cè)腦室注射LPS12小時(shí)后海馬齒狀回TRAF6，TRIF和NF-κB的表達(dá)水平均顯著升高；而孕期乙醇暴露組則沒(méi)有觀察到顯著變化。 第三部分；分別給予3組子代大鼠（生后30天）側(cè)腦室立體定位注射MyD88抑制肽及其對(duì)照肽，12小時(shí)后Western Blot檢測(cè)大鼠全腦中TLR4、NF-κBp50、pI-κB3種蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果：對(duì)照組子代大鼠側(cè)腦室注射MyD88抑制肽12小時(shí)后TLR4、NF-κBp50、pI-κB的蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)；而孕期乙醇暴露組未見(jiàn)顯著差異。 總結(jié)論：（1）新生大鼠（即使剛出生1天）CNS TLR4介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答已基本完備，且新生大鼠BBB的結(jié)構(gòu)和功能也已基本完備；（2）孕期乙醇暴露對(duì)新生大鼠CNS發(fā)育的形態(tài)學(xué)影響有限；（3）孕期乙醇暴露子代大鼠CNS TLR4介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答的受到抑制，同時(shí)孕期乙醇暴露可使子代大鼠腦內(nèi)部分炎性因子基礎(chǔ)表達(dá)量上調(diào)，如TRIF，TNFα，IL-1β和IFN；（4）孕期乙醇暴露可影響子代大鼠CNS TLR4介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制。 本研究表明孕期乙醇暴露可影響子代大鼠CNS TLR4介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)。雖然機(jī)制尚未明確，但在此基礎(chǔ)上的進(jìn)一步研究定會(huì)有助于深入認(rèn)識(shí)孕期乙醇暴露對(duì)新生兒CNS發(fā)育的影響，并可能找到阻斷這種影響的有效途徑，減少新生兒CNS出生缺陷的發(fā)生率，做到優(yōu)生優(yōu)育。甚至還可能為治療慢性神經(jīng)、精神性疾病找到新的突破點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R715.3

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本文編號(hào)：2415650