【摘要】：促性腺激素是人類輔助生殖技術(shù)(ART)控制性促排卵中常用的藥物。在美國,依賴該藥物誕生的試管嬰兒占出生嬰兒的1%以上。目前,臨床上常使用的促性腺激素藥物包括Gonal-F, Follism, Bravelle, Luveris, Menopur, Repronex, Norvarel等。促性腺激素在促進多個竇卵泡發(fā)育至優(yōu)勢卵泡以及激素藥物替代中起到至關(guān)重要的作用。卵泡刺激素(FSH)是復(fù)雜的異質(zhì)二聚體糖蛋白,由二個非共價鍵及α和β蛋白亞單位構(gòu)成。FSH相對分子質(zhì)量約30 000 Da。卵泡刺激素是卵泡成熟及產(chǎn)生類固醇激素必需的激素。同時,FSH能促進卵泡生長,刺激顆粒細胞上細胞色素P450家族中芳香化酶的表達；FSH能夠產(chǎn)生減數(shù)分裂活性物質(zhì),啟動卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)。減數(shù)分裂的恢復(fù)以卵母細胞核膜的破裂為標志。大量的研究表明,卵泡液中高FSH水平將導(dǎo)致受精失敗、胚胎發(fā)育異常及種植失敗。但小劑量促性腺激素不足以刺激卵巢產(chǎn)生足夠多卵子用于常規(guī)體外受精-胚胎移植(IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)。促性腺激素應(yīng)用的劑量及聯(lián)合用藥方案是否影響卵母細胞成熟及其發(fā)育,其機制尚不清楚。體外研究表明,FSH誘導(dǎo)卵丘細胞上某信號的合成,克服了次黃嘌呤對減數(shù)分裂的阻滯。研究發(fā)現(xiàn)促減數(shù)分裂甾醇(MAS)可誘導(dǎo)體外卵母細胞甚至裸卵成熟。MAS是膽固醇生物合成中羊毛甾醇合成膽固醇的中間產(chǎn)物。MAS家族中最具特點的是從人卵泡液中提取的FF-MAS和牛睪丸組織的T-MAS。FSH是否通過MAS作為信號傳導(dǎo)分子誘導(dǎo)卵母細胞成熟或者通過MAS誘導(dǎo)的減數(shù)分裂恢復(fù),目前仍然不清楚。1.研究不同濃度Gonal-F; Follism; Bravelle;Luveris;Menopur; Repronex;Norvarel和配對組合促性腺激素Bravelle+Menopur； Bravelle+Repronex和Bravelle+Norvarel行牛未成熟卵母細胞體外成熟培養(yǎng),評估卵母細胞成熟程度,為優(yōu)化臨床促排卵方案以及提高IVF成功率提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。2.研究六組配對促性腺激素Follism+Repronex; Follism+Menopur； Brayclle+Repronex;Bravelle+M-nopur;Gonal-F+Repronex和Gonal-F+Menopur對牛未成熟卵母細胞行體外成熟培養(yǎng)并授精,評估卵母細胞成熟及胚胎發(fā)育情況,篩選出最優(yōu)的配對促性腺激素,為臨床ART促排卵方案的選擇提供理論依據(jù)。3.探討三種不同濃度促性腺激素Gonal-F; Follism和Fostimon對大鼠肝S9孵育體系中膽固醇含量的影響,為進一步研究促性腺激素作用機制奠定基礎(chǔ)。1標本來源購買美國Minitube公司5202枚牛未成熟卵母細胞,卵泡直徑約4-6 mm(GV,MI階段)；購買河南省實驗動物中心健康成年雄性SD大鼠(體重200±20g)20只。2實驗方法2.1 IVM培養(yǎng)3921枚牛未成熟卵母細胞培養(yǎng)于不同分組不同濃度的促性腺激素與含10%胎牛血清的TCM-199培養(yǎng)基中, 置于39℃,5%CO2培養(yǎng)箱進行成熟培養(yǎng)。實驗分為十組,分別為Gonal-F,Follism,Bravelle,Luveris,Menopur, Repronex,Norvarel;Bravelle+Menopur;Bravelle+Repronex和Bravelle+Norvarel。每種藥物濃度分別為0,5,10,20,40IU/mL(Norvarel的單位是USP/mL);培養(yǎng)24h、48h后,解剖顯微鏡下評估COCs擴展程度,倒置顯微鏡下評估卵母細胞核成熟(GV,MI,MII)及第一極體排出情況。2.2牛精子授精及胚胎培養(yǎng)1281枚牛未成熟卵母細胞加入不同分組的促性腺激素與含10%胎牛血清的TCM-199培養(yǎng)基中行成熟培養(yǎng),24h后進行牛精子授精。受精后放于10%胎牛血清TCM-199培養(yǎng)基中,置39℃,5%CO2培養(yǎng)箱中進行胚胎培養(yǎng)。實驗分為六組,分別為Follism+Repronex; Follism+Menopur; Bravelle +Repronex; Bravelle+Menopur;Gonal-F+Repronex和Gonal-F+Menopur,未添加藥物組設(shè)為空白對照組。每種藥物濃度為40IU/mL。卵母細胞成熟培養(yǎng)24h后與牛精子進行授精,授精后24、48、72、96h觀察胚胎發(fā)育情況并評估,培育7-8天評估桑椹胚-囊胚發(fā)育情況。2.3大鼠肝S9孵育體系添加不同F(xiàn)SH后檢測膽固醇含量購買20只雄性成年大鼠,制備大鼠肝S9孵育體系。將三種FSH藥物Gonal-F;Follism和Fostimon配制成高中低三個濃度,加入其中,孵育不同時間,用LC.MSMS方法測定大鼠肝S9中的膽固醇濃度。3.統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)士標準差(x士S)表示,統(tǒng)計數(shù)據(jù)比較采用多因素方差分析和卡方檢驗,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。1體外卵母細胞成熟情況無論單種還是配對促性腺激素行體外卵母細胞成熟培養(yǎng)均劑量依賴性顯著性促進COCs的擴展。Bravelle,Luvens,Menopur和Repronex培養(yǎng)24h后顯著性擴展COCs:然而,Norvarel依劑量依賴的方式促進卵母細胞COCs的擴展(10到40IU/m L;P005）。20或40IU/mL Bravelle(B),Luvens(L),Menopur(M),Repronex(R),Gonal-F(G),Follism(F)以及20或40 USP/mL Norvarel (N)培養(yǎng)24h和48h卵母細胞成熟率分別是20IU/mL B為13.1%和45.0%:40 IU/mL B 為25.0%和57.1%20 IU/mL的L為33.3%和37.5%40 IU/mL的L為 33.3%和53.6%;20 IU/mL M為50.0%和71.4%; 40 IU/mL M為56.3%和 76.2%;20 IU/mL R為53.8%和81.3%;40 IU/mL R為55.0%和81.8%;20 IU/mL G為15.1%和16.2%;40 IU/mL G為38.9%和39.5%;l20 IU/mL F為22.2%和39.2%;40 IU/mL F為37.3%和40.6%20 USP/mL N為37.5%和44.4%以及40 USP/mL N為40.0%和71.4%。配對藥物組在10或40 IU/mL的M+B,R+B和B+N體外卵母細胞成熟培養(yǎng)24和48h,卵母細胞成熟率分別是M+B(10 IU/mL)為37.9%和66.7%：M+B(40 IU/mL)為80.0%和73.9%R+B(10 IU/mL)為50.0%和73.9%;R+B(40 IU/mL)為81.8%和78.9%;B+N(10 IU/mL)為52.4%和75.0%以及B+N(40 IU/mL)為56.2%和62.5%。實驗結(jié)果顯示高濃度促性腺激素在單種(如N和F)或配對組(如B+N)體外成熟培養(yǎng)48h將導(dǎo)致成熟障礙,所以,促性腺激素濃度在40 IU/mL時行體外成熟培養(yǎng)最合適的時間是24h。2 IVF和早期胚胎發(fā)育配對促性腺激素(40 IU/mL)培養(yǎng)24h后,R+F,M+F,R+B,M+B,R+G,M+G與空白對照組比較,卵母細胞成熟率分別是88.4%,93.4%,80.7%,80.9%,82.0%,81.7%和14.19%(P0.05),受精率分別是67.8%,68.2%,71.5%,68.7%,72.1%,63.1%和33.9%(P0.05).8-16細胞胚胎率分別是33.3%,34.1%,40.0%,50.0%,41.5%和31.3%(P0.05)；桑椹胚-囊胚率分別是21.2%,20.5%,26.0%,30.0%,26.8%和25.0%(P0.05)。3 LC-MSMS方法測定膽固醇的線性范圍,62.5-1000ng/ml�；厥章矢�,97.5-102.4%；精密度好,RSD3%。4 Follism,Gonal-F促進大鼠肝S9孵育體系中膽固醇的合成,Fostimon促進大鼠肝S9孵育體系中膽固醇的代謝。Follism在大鼠肝S9孵育體系中膽固醇的濃度在0-20min區(qū)間是增加的,且有濃度依賴關(guān)系；隨著孵育時間及濃度的增加,在20min-40min之間,則成下降趨勢；隨著孵育時間的延長,低濃度的Follism組在40min后,其膽固醇的濃度隨之增大,而中、高劑量則在40min-80min升高,80min后開始下降。低劑量的Gonal-F組與對照組比較,在大鼠肝S9孵育體系中膽固醇的濃度在0-100min區(qū)間,逐步增加到孵育4Omin后為峰值,然后逐漸下降,與空白組接近。而高、中劑量組變化趨勢與低劑量相似,但是變化區(qū)間小與低劑量。低劑量的Fostimon組在大鼠肝S9孵育體系中膽固醇的濃度與對照組比較,在0-100min區(qū)間是先減少的,到孵育20mmin后為谷值,然后逐漸升高,與空白組接近,且有劑量依賴關(guān)系。結(jié)論1.七種促性腺激素藥物(Gonal-F; Follism; Bravelle;Luveris Menopur; Repronex；Norvarel)在體外培養(yǎng)未成熟卵母細胞可顯著性增加COCs擴展及卵母細胞成熟,其中,Menopur和Repronex作用最強,配對組則以Menopur +Follism為著。2.促性腺激素包括FSH.LH及hCG三類分別與體外牛未成熟卵母細胞培養(yǎng)48h均促進卵母細胞成熟。3.六組配對促性腺激素(Follism+Repronex; Follism+Menopur;Bravelle +Repronex; Bravelle+Menopur;Gonal-F+Repronex和Gonal-F+Menopur)影響胚胎2細胞前的卵母細胞發(fā)育及早期胚胎的形成；對未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)形成的囊胚,在形態(tài)學(xué)上比較沒有顯著性差異。4.LC-MSMS是一種簡便,快速和靈敏度高的一種測定方法,可用于大鼠肝S9孵育體系中膽固醇含量測定。重組人FSH和尿源性FSH對膽固醇合成代謝的影響不同,可能與二者促進卵母細胞的成熟機制相關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R714.8
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本文編號：2402020