【摘要】：研究背景 卵巢癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，由于缺乏有效的早期診斷方法，死亡率仍然位于女性生殖器惡性腫瘤之首[1]，75%的患者確診時已到晚期，五年生存率僅為30%-40%[2]。目前對卵巢癌治療的標(biāo)準(zhǔn)方案是在腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的基礎(chǔ)上施以紫杉醇與鉑類藥物為主的聯(lián)合化療，然而隨著耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，常常使治療無效，已成為嚴(yán)重威脅女性生命的最大疾患。因此，卵巢癌的預(yù)防和治療已成為婦科腫瘤研究的最重要課題之一。 FoxM1為Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族重要的成員之一，是與癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子。它由10個外顯子構(gòu)成，且定位在約20kb的染色體端粒位置12p13-3。FoxM1具有三種剪接異構(gòu)體，即FoxM1A，B和C，其中FoxM1B和C在癌組織中高表達(dá)，在正常細(xì)胞和組織中低表達(dá)[3-5]，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活、促癌發(fā)生和發(fā)展的作用，而FoxM1A在癌組織中低表達(dá)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制功能。作為一個轉(zhuǎn)錄因子，其主要功能為通過轉(zhuǎn)錄激活細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，加快腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程；轉(zhuǎn)錄激活VEGF，促進(jìn)腫瘤血管的生成；轉(zhuǎn)錄激活MMP2、MMP9，促進(jìn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。另外，大量的生物芯片研究表明FoxM1與卵巢癌密切相關(guān)[6]。因此，F(xiàn)oxM1是一個重要的腫瘤標(biāo)志物，對于卵巢癌診斷及治療都具有重要意義。 在真核生物基因表達(dá)調(diào)控中，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是最重要的環(huán)節(jié)，它是通過特定的轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的調(diào)控序列及其啟動子的特異性結(jié)合才能有效的調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。但是到目前還沒有關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子與FoxM1基因核心啟動子區(qū)特異性結(jié)合并能夠有效地調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性的相關(guān)報道。因此，通過對FoxM1基因啟動子的克隆，研究其表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，為闡明FoxM1基因的生物學(xué)功能及與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系提供了理論基礎(chǔ)。 目前普遍認(rèn)為，基因組DNA異常甲基化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，CpG島的局部甲基化是惡性腫瘤中存在的普遍現(xiàn)象，它往往早于明顯的惡性表型出現(xiàn)。大量的研究證明了DNA甲基化可影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到含有CpG島的識別序列，從而調(diào)控基因的表達(dá)。因此，研究FoxM1啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與卵巢癌的相關(guān)性，以及探討DNA甲基化對FoxM1轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，對于理解卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制具有重要的意義，為卵巢癌的早期診斷及靶向治療提供新的思路。 目的 1.明確FoxM1在卵巢癌細(xì)胞及卵巢癌組織中的表達(dá)； 2.明確FoxM1核心啟動子區(qū)域； 3.初步探討轉(zhuǎn)錄因子Sp1對FoxM1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用； 4.確定在卵巢癌中，DNA甲基化修飾與FoxM1表達(dá)調(diào)控的關(guān)系，，評價FoxM1在卵巢癌的早期診斷和治療中應(yīng)用的可行性。 內(nèi)容及方法 1.檢測FoxM1在卵巢癌細(xì)胞系及卵巢癌組組織中的表達(dá) 1）我們用實時熒光定量PCR和Western blot技術(shù)分別檢測了FoxM1在卵巢癌細(xì)胞系（HO-8910PM、HO-8910、A2780和CP70）中的表達(dá)水平。 2）同時我們運(yùn)用實時熒光定量PCR和免疫組化技術(shù)分別檢測了35例上皮性卵巢癌組織、40例正常卵巢組織的表達(dá)情況。 2.確定FoxM1核心啟動子區(qū)域 我們以正常人外周血基因組DNA為模板，用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增構(gòu)建了6個長度不同但相互重疊的FoxM1基因啟動子報告基因系列截短載體,通過瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，運(yùn)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)確定FoxM1基因核心啟動子區(qū)域。 3.明確轉(zhuǎn)錄因子Sp1對FoxM1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用 我們用Sp1基因真核表達(dá)質(zhì)粒和報告基因質(zhì)粒共同分別轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞（順鉑敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780和順鉑耐藥細(xì)胞系CP70），對照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.0空載體，運(yùn)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測Sp1對FoxM1基因轉(zhuǎn)錄激活作用。 4. DNA甲基化修飾與FoxM1基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系 我們運(yùn)用CpG島搜索軟件CpGPLOT分析了FoxM1的啟動子序列，然后，我們用亞硫酸鹽克隆測序法檢測了卵巢癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HO-8910PM，低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HO-8910，順鉑敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780和順鉑耐藥細(xì)胞系CP70的中FoxM1核心啟動子區(qū)甲基化狀況；同時我們又運(yùn)用焦磷酸測序技術(shù)分別對15例上皮性卵巢癌組織、14例正常卵巢組織中FoxM1核心啟動子區(qū)甲基化情況進(jìn)行了檢測。 結(jié)果 1.實時熒光定量PCR和Western blot結(jié)果顯示FoxM1在卵巢癌細(xì)胞系（HO-8910PM、HO-8910、A2780和CP70）中均高表達(dá)；同時實時熒光定量PCR和免疫組化結(jié)果顯示FoxM1在卵巢癌組織中的表達(dá)水平（30/35=86%）顯著高于正常卵巢組織（6/40=15%，P 0.01），有統(tǒng)計學(xué)意義，而且這種高表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上是一致的。 2.雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1核心啟動子區(qū)位于其轉(zhuǎn)錄起始點上游+1～-95bp這段序列中。 3.熒光素酶報告基因系統(tǒng)實驗結(jié)果顯示，Sp1結(jié)合到FoxM1核心啟動子區(qū)并對其有轉(zhuǎn)錄激活作用。 4.亞硫酸鹽克隆測序法檢測結(jié)果顯示，卵巢癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HO-8910PM，低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系HO-8910，順鉑敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780和順鉑耐藥細(xì)胞系CP70四株細(xì)胞系中FoxM1核心啟動子區(qū)的甲基化程度均很低。另外，用焦磷酸測序技術(shù)檢測結(jié)果顯示，15例上皮性卵巢癌組織、14例正常卵巢組織中FoxM1核心啟動子區(qū)均存在著一定程度的低甲基化，且二者之間沒有明顯的差異（P0.05），沒有統(tǒng)計學(xué)意義，與其在卵巢癌細(xì)胞系中的甲基化程度基本一致。這些結(jié)果說明，在卵巢癌中DNA甲基化修飾可能不參與FoxM1的表達(dá)調(diào)控。 結(jié)論 1. FoxM1在正常卵巢組織中低表達(dá)或者不表達(dá)，而在四株卵巢癌細(xì)胞系和上皮性卵巢癌組織中的均高表達(dá)，并且這種高表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上是基因一致的，提示FoxM1基因與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)。 2.首次確定了FoxM1核心啟動子區(qū)位于其轉(zhuǎn)錄起始點上游+1bp～-95bp這段序列中，為進(jìn)一步研究FoxM1與腫瘤關(guān)系的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 3.確定了Sp1上調(diào)FoxM1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，使我們能夠期望解釋為什么FoxM基因在卵巢癌中高表達(dá)以及在侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。 4.確定了卵巢癌細(xì)胞、卵巢癌組織和正常卵巢組織中FoxM1核心啟動子區(qū)均存在著一定程度的低甲基化，但三者甲基化程度基本一致，沒有統(tǒng)計學(xué)意義，提示在卵巢癌中DNA甲基化修飾可能不參與FoxM1的表達(dá)調(diào)控。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 封彥青;Shh和Foxm1在膽囊癌中的表達(dá)和臨床意義及其與腫瘤的關(guān)系[D];南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2015年

本文編號：2347609