發(fā)布時(shí)間：2018-11-21 17:13

【摘要】：目的:上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer，EOC）是一種高度惡性的婦科腫瘤，不易早期發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)病人在診斷時(shí)即已發(fā)生局部或全身轉(zhuǎn)移。目前卵巢癌的治療方法主要為徹底的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以鉑類藥物為主的化療。卵巢癌對化療藥物產(chǎn)生耐藥性和侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生使其五年生存率徘徊在30%左右，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首。因此，研究耐藥性EOC的轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)顯得尤為迫切。 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是上皮性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也與化療抵抗關(guān)系密切。在EMT過程中，上皮細(xì)胞發(fā)生了典型的形態(tài)學(xué)改變，即由鵝卵石樣上皮表型轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭樣的間質(zhì)表型；上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如Vimentin、N-cadherin等表達(dá)增加，上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞之間連接松散，細(xì)胞骨架重塑而獲得運(yùn)動(dòng)能力。因此，阻斷或逆轉(zhuǎn)EMT的發(fā)生有望抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)化療療效。 內(nèi)源性非編碼小RNA(microRNA,miRNA)是一類由20～25個(gè)核苷酸組成的短小非編碼蛋白質(zhì)的RNAs，廣泛存在于真核生物中。miRNA通過堿基配對結(jié)合到靶基因mRNA的3端非編碼區(qū)(3'untranslatedregions,3'UTR)，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制，在表觀遺傳學(xué)和基因表達(dá)調(diào)控方面起到重要作用。miRNAs是上皮癌發(fā)生EMT過程的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，其中miR-200家族與卵巢癌關(guān)聯(lián)較多。卵巢癌miR-200c/ZEB1負(fù)反饋環(huán)路與EMT關(guān)系更密切，miR-200c表達(dá)減少，增加ZEB1表達(dá)，導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)減少，促進(jìn)EMT的發(fā)生，細(xì)胞間黏附性降低，移動(dòng)性增強(qiáng)。但是miR-200c在癌細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制仍未完全闡明。 Notch信號(hào)通路是一個(gè)高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在細(xì)胞發(fā)育和決定細(xì)胞分化命運(yùn)過程中起關(guān)鍵作用，該通路的失調(diào)與多種癌癥的發(fā)生及耐藥密切相關(guān)。在肺腺癌、胰腺癌研究證實(shí)，活化Notch信號(hào)途徑，可降低miR-200c表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT。但Notch信號(hào)途徑與miR-200c表達(dá)在耐藥性卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用及其作用機(jī)制，需要進(jìn)一步研究的證實(shí)。DAPT是一種人工合成的γ-分泌酶抑制劑，是被公認(rèn)的Notch信號(hào)通路阻斷劑。由此，我們推測，，miR-200c是notch途徑的一個(gè)靶向因子，應(yīng)用DAPT抑制notch-1表達(dá)后，可上調(diào)miR-200c表達(dá)，逆轉(zhuǎn)EMT表型，減弱細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。 本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3和順鉑耐藥人卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞株SKOV3/DDP，以DAPT為處理因素，旨在研究Notch信號(hào)途徑與miR-200c表達(dá)在耐藥性卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行探索，以期為上皮性卵巢癌的治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃，飽和濕度5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞和SKOV3/DDP細(xì)胞。 1倒置顯微鏡:以SKOV3細(xì)胞為陰性對照組，SKOV3/DDP細(xì)胞為空白對照組，和不同濃度DAPT(25、50、75μmol/L)處理SKOV3/DDP細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞培養(yǎng)48h后應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。 2MTT法：培養(yǎng)SKOV3/DDP細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后用不同濃度DAPT(25、50、75μmol/L)作用不同時(shí)間(24h、48h、72h)，以DAPT0μmol/L為空白對照組。采用MTT法檢測藥物對細(xì)胞生長的影響，篩選出藥物作用的最適濃度及時(shí)間。 3蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)：以SKOV3細(xì)胞為陰性對照組，SKOV3/DDP細(xì)胞為空白對照組，和50μmol/L DAPT處理SKOV3/DDP細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞培養(yǎng)48h后提取總蛋白，應(yīng)用Nano-drop儀和BCA法檢測總蛋白濃度，應(yīng)用Western blotting檢測上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin蛋白和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin蛋白表達(dá)。 4實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）：細(xì)胞分組同Western blotting，細(xì)胞培養(yǎng)48h后提取總RNA，應(yīng)用Nano-drop儀檢測總RNA濃度，應(yīng)用RT-PCR檢測Notch-1mRNA和ZEB1mRNA的表達(dá)量。用SYBR GreenⅠRT-PCR方法檢測miR-200c轉(zhuǎn)錄水平的變化情況。 5細(xì)胞劃痕試驗(yàn)：以SKOV3細(xì)胞為陰性對照組，以SKOV3/DDP細(xì)胞為空白對照組，以50μmol/L DAPT處理SKOV3/DDP細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，應(yīng)用無血清培養(yǎng)基同步，加入不同刺激后再做劃痕，拍照。48h后再拍照觀察不同組間劃痕愈合情況的不同。 6應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1倒置相差顯微鏡下觀察SKOV3細(xì)胞形態(tài)為典型的鋪路石樣，細(xì)胞排列規(guī)則緊湊；SKOV3/DDP細(xì)胞形態(tài)為多角星形，伸出偽足，細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞間連接較疏松。在不同濃度DAPT(25、50和75μmol/L)作用48h后，SKOV3/DDP細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生變化，部分細(xì)胞偽足縮短，呈多角形，細(xì)胞排列也更緊密。 2MTT與空白對照組相比，隨著DAPT作用濃度(25、50和75μmol/L)的增加和作用時(shí)間（24h，48h和72h）的延長，SKOV3/DDP細(xì)胞的抑制率明顯增加(P0.05)。不同濃度DAPT處理72h后各組細(xì)胞活力明顯下降，細(xì)胞死亡更明顯。75μmol/L DAPT處理組細(xì)胞在相同時(shí)間時(shí)抑制率最高，而25μmol/L處理細(xì)胞組的抑制率較低。因此為維持細(xì)胞的活力又可發(fā)揮藥物作用，對于SKOV3/DDP細(xì)胞后續(xù)實(shí)驗(yàn)DAPT的作用濃度選為50μmol/L，將48h定為DAPT作用SKOV3/DDP細(xì)胞的最佳時(shí)間。 3Western blotting 3.1細(xì)胞培養(yǎng)48h后,空白對照組SKOV3/DDP細(xì)胞上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin(0.072±0.043)表達(dá)較陰性對照組SKOV3細(xì)胞(0.867±0.121)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物Vimentin(3.221±0.238)表達(dá)升高，與陰性對照組相比(0.523±0.069)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.250μ mol/LDAPT溶液作用于SKOV3/DDP細(xì)胞48小時(shí)后E-cadherin表達(dá)量為（0.324±0.039），與空白對照組（0.072±0.043）相比，E-cadherin蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。50μmol/L DAPT處理SKOV3/DDP細(xì)胞48h后，Vimentin蛋白的表達(dá)(1.873±0.177)相對于空白對照組（3.221±0.238）明顯減少(P0.05)。 4RT-PCR 4.1SKOV3細(xì)胞和SKOV3/DDP細(xì)胞中Notch-1mRNA表達(dá) 與陰性對照組SKOV3細(xì)胞（1.000±0.000）相比，空白對照組SKOV3/DDP細(xì)胞中Notch-1mRNA表達(dá)量（2.854±0.600）明顯增加(P0.05)。應(yīng)用50μmol/L濃度DAPT作用SKOV3/DDP細(xì)胞48h后，與空白對照組相比，Notch-1mRNA表達(dá)量（1.973±0.567）明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 4.2miR-200c和ZEB1mRNA表達(dá)變化 SKOV3細(xì)胞中miR-200c表達(dá)量（1.000±0.000）明顯低于空白對照組（0.203±0.027），而空白對照組中ZEB1mRNA表達(dá)量（7156.100±581.336）明顯高于陰性對照組（1.000±0.000），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。應(yīng)用50μmol/LDAPT作用SKOV3/DDP細(xì)胞48h后，與空白對照組相比，miR-200c表達(dá)量（0.430±0.243）增加，而ZEB1mRNA表達(dá)量（2527.800±1109.512）減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 5劃痕試驗(yàn)： 劃痕試驗(yàn)步驟和遷移力評估同前，與SKOV3細(xì)胞相比，SKOV3/DDP細(xì)胞愈合面積明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。經(jīng)50μmol/L濃度DAPT作用48h后，與空白對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移力明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 1順鉑耐藥的SKOV3/DDP細(xì)胞的轉(zhuǎn)移力強(qiáng)于順鉑敏感的SKOV3細(xì)胞。 2SKOV3/DDP細(xì)胞表現(xiàn)為典型的鋪路石樣上皮細(xì)胞類型，E-cadherin蛋白的表達(dá)高，Vimentin蛋白的表達(dá)低； SKOV3/DDP細(xì)胞獲得間質(zhì)類型形態(tài)，為不規(guī)則多角形，Vimentin蛋白高表達(dá)，而E-cadherin蛋白低表達(dá)。 3Notch信號(hào)通路與miR-200c異常表達(dá)相關(guān)。應(yīng)用Notch信號(hào)阻斷劑DAPT作用SKOV3/DDP細(xì)胞后，促進(jìn)miR-200c表達(dá)，減少ZEB1mRNA表達(dá)，進(jìn)而部分逆轉(zhuǎn)EMT，上調(diào)E-cadherin蛋白的表達(dá)，下調(diào)Vimentin蛋白的表達(dá)，減弱細(xì)胞的轉(zhuǎn)移力。 4Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路、miR-200c異常表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞獲得耐藥表型和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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1 常靚;劉巍;;miRNA-200家族在人類腫瘤中的研究進(jìn)展[J];腫瘤防治研究;2012年04期

2 成榮杰;范艷艷;付艷;;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化與婦科惡性腫瘤[J];國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志;2012年01期

3 賀慧鵬;廖愛軍;;MicroRNA與腫瘤的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2012年04期

本文編號(hào)：2347664