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Notch信號通路在鉑耐藥性卵巢癌細胞株中作用及機制的初步研究

發(fā)布時間:2018-11-21 17:13
【摘要】:目的:上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)是一種高度惡性的婦科腫瘤,不易早期發(fā)現(xiàn),絕大多數(shù)病人在診斷時即已發(fā)生局部或全身轉移。目前卵巢癌的治療方法主要為徹底的腫瘤細胞減滅術和以鉑類藥物為主的化療。卵巢癌對化療藥物產生耐藥性和侵襲轉移的發(fā)生使其五年生存率徘徊在30%左右,死亡率居婦科惡性腫瘤之首。因此,研究耐藥性EOC的轉移機制,尋找有效的干預靶點顯得尤為迫切。 上皮間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是上皮性腫瘤發(fā)生侵襲轉移過程中的關鍵環(huán)節(jié),也與化療抵抗關系密切。在EMT過程中,上皮細胞發(fā)生了典型的形態(tài)學改變,即由鵝卵石樣上皮表型轉變?yōu)殚L梭樣的間質表型;上皮標志物E-cadherin表達降低,間質細胞標志物如Vimentin、N-cadherin等表達增加,上皮細胞失去極性,細胞之間連接松散,細胞骨架重塑而獲得運動能力。因此,阻斷或逆轉EMT的發(fā)生有望抑制腫瘤的侵襲轉移,增強化療療效。 內源性非編碼小RNA(microRNA,miRNA)是一類由20~25個核苷酸組成的短小非編碼蛋白質的RNAs,廣泛存在于真核生物中。miRNA通過堿基配對結合到靶基因mRNA的3端非編碼區(qū)(3'untranslatedregions,3'UTR),導致mRNA降解或翻譯抑制,在表觀遺傳學和基因表達調控方面起到重要作用。miRNAs是上皮癌發(fā)生EMT過程的一個關鍵調節(jié)者,其中miR-200家族與卵巢癌關聯(lián)較多。卵巢癌miR-200c/ZEB1負反饋環(huán)路與EMT關系更密切,miR-200c表達減少,增加ZEB1表達,導致E-cadherin表達減少,促進EMT的發(fā)生,細胞間黏附性降低,移動性增強。但是miR-200c在癌細胞中的表達調節(jié)機制仍未完全闡明。 Notch信號通路是一個高度保守的信號傳導通路,在細胞發(fā)育和決定細胞分化命運過程中起關鍵作用,該通路的失調與多種癌癥的發(fā)生及耐藥密切相關。在肺腺癌、胰腺癌研究證實,活化Notch信號途徑,可降低miR-200c表達,促進腫瘤細胞發(fā)生EMT。但Notch信號途徑與miR-200c表達在耐藥性卵巢癌細胞轉移中的作用及其作用機制,需要進一步研究的證實。DAPT是一種人工合成的γ-分泌酶抑制劑,是被公認的Notch信號通路阻斷劑。由此,我們推測,,miR-200c是notch途徑的一個靶向因子,應用DAPT抑制notch-1表達后,可上調miR-200c表達,逆轉EMT表型,減弱細胞轉移能力。 本實驗通過體外培養(yǎng)人卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3和順鉑耐藥人卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3/DDP,以DAPT為處理因素,旨在研究Notch信號途徑與miR-200c表達在耐藥性卵巢癌細胞轉移中的作用,并對其作用機制進行探索,以期為上皮性卵巢癌的治療提供新的思路和實驗依據(jù)。 方法:用含10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃,飽和濕度5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)SKOV3細胞和SKOV3/DDP細胞。 1倒置顯微鏡:以SKOV3細胞為陰性對照組,SKOV3/DDP細胞為空白對照組,和不同濃度DAPT(25、50、75μmol/L)處理SKOV3/DDP細胞為實驗組,細胞培養(yǎng)48h后應用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。 2MTT法:培養(yǎng)SKOV3/DDP細胞進入對數(shù)生長期后用不同濃度DAPT(25、50、75μmol/L)作用不同時間(24h、48h、72h),以DAPT0μmol/L為空白對照組。采用MTT法檢測藥物對細胞生長的影響,篩選出藥物作用的最適濃度及時間。 3蛋白質印跡(Western blotting):以SKOV3細胞為陰性對照組,SKOV3/DDP細胞為空白對照組,和50μmol/L DAPT處理SKOV3/DDP細胞為實驗組,細胞培養(yǎng)48h后提取總蛋白,應用Nano-drop儀和BCA法檢測總蛋白濃度,應用Western blotting檢測上皮細胞標記物E-cadherin蛋白和間質細胞標記物Vimentin蛋白表達。 4實時熒光定量PCR(RT-PCR):細胞分組同Western blotting,細胞培養(yǎng)48h后提取總RNA,應用Nano-drop儀檢測總RNA濃度,應用RT-PCR檢測Notch-1mRNA和ZEB1mRNA的表達量。用SYBR GreenⅠRT-PCR方法檢測miR-200c轉錄水平的變化情況。 5細胞劃痕試驗:以SKOV3細胞為陰性對照組,以SKOV3/DDP細胞為空白對照組,以50μmol/L DAPT處理SKOV3/DDP細胞為實驗組,應用無血清培養(yǎng)基同步,加入不同刺激后再做劃痕,拍照。48h后再拍照觀察不同組間劃痕愈合情況的不同。 6應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以x±s表示,檢驗水準α=0.05,P0.05差異有統(tǒng)計學意義。 結果: 1倒置相差顯微鏡下觀察SKOV3細胞形態(tài)為典型的鋪路石樣,細胞排列規(guī)則緊湊;SKOV3/DDP細胞形態(tài)為多角星形,伸出偽足,細胞排列不規(guī)則,細胞間連接較疏松。在不同濃度DAPT(25、50和75μmol/L)作用48h后,SKOV3/DDP細胞形態(tài)開始發(fā)生變化,部分細胞偽足縮短,呈多角形,細胞排列也更緊密。 2MTT與空白對照組相比,隨著DAPT作用濃度(25、50和75μmol/L)的增加和作用時間(24h,48h和72h)的延長,SKOV3/DDP細胞的抑制率明顯增加(P0.05)。不同濃度DAPT處理72h后各組細胞活力明顯下降,細胞死亡更明顯。75μmol/L DAPT處理組細胞在相同時間時抑制率最高,而25μmol/L處理細胞組的抑制率較低。因此為維持細胞的活力又可發(fā)揮藥物作用,對于SKOV3/DDP細胞后續(xù)實驗DAPT的作用濃度選為50μmol/L,將48h定為DAPT作用SKOV3/DDP細胞的最佳時間。 3Western blotting 3.1細胞培養(yǎng)48h后,空白對照組SKOV3/DDP細胞上皮細胞標記物E-cadherin(0.072±0.043)表達較陰性對照組SKOV3細胞(0.867±0.121)明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);間質細胞標記物Vimentin(3.221±0.238)表達升高,與陰性對照組相比(0.523±0.069),差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.250μ mol/LDAPT溶液作用于SKOV3/DDP細胞48小時后E-cadherin表達量為(0.324±0.039),與空白對照組(0.072±0.043)相比,E-cadherin蛋白的表達差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。50μmol/L DAPT處理SKOV3/DDP細胞48h后,Vimentin蛋白的表達(1.873±0.177)相對于空白對照組(3.221±0.238)明顯減少(P0.05)。 4RT-PCR 4.1SKOV3細胞和SKOV3/DDP細胞中Notch-1mRNA表達 與陰性對照組SKOV3細胞(1.000±0.000)相比,空白對照組SKOV3/DDP細胞中Notch-1mRNA表達量(2.854±0.600)明顯增加(P0.05)。應用50μmol/L濃度DAPT作用SKOV3/DDP細胞48h后,與空白對照組相比,Notch-1mRNA表達量(1.973±0.567)明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4.2miR-200c和ZEB1mRNA表達變化 SKOV3細胞中miR-200c表達量(1.000±0.000)明顯低于空白對照組(0.203±0.027),而空白對照組中ZEB1mRNA表達量(7156.100±581.336)明顯高于陰性對照組(1.000±0.000),差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。應用50μmol/LDAPT作用SKOV3/DDP細胞48h后,與空白對照組相比,miR-200c表達量(0.430±0.243)增加,而ZEB1mRNA表達量(2527.800±1109.512)減少,差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 5劃痕試驗: 劃痕試驗步驟和遷移力評估同前,與SKOV3細胞相比,SKOV3/DDP細胞愈合面積明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。經50μmol/L濃度DAPT作用48h后,與空白對照組相比,實驗組細胞遷移力明顯減弱,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論: 1順鉑耐藥的SKOV3/DDP細胞的轉移力強于順鉑敏感的SKOV3細胞。 2SKOV3/DDP細胞表現(xiàn)為典型的鋪路石樣上皮細胞類型,E-cadherin蛋白的表達高,Vimentin蛋白的表達低; SKOV3/DDP細胞獲得間質類型形態(tài),為不規(guī)則多角形,Vimentin蛋白高表達,而E-cadherin蛋白低表達。 3Notch信號通路與miR-200c異常表達相關。應用Notch信號阻斷劑DAPT作用SKOV3/DDP細胞后,促進miR-200c表達,減少ZEB1mRNA表達,進而部分逆轉EMT,上調E-cadherin蛋白的表達,下調Vimentin蛋白的表達,減弱細胞的轉移力。 4Notch信號傳導通路、miR-200c異常表達與卵巢癌細胞獲得耐藥表型和轉移能力有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】:河北醫(yī)科大學
【學位級別】:碩士
【學位授予年份】:2014
【分類號】:R737.31

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 常靚;劉巍;;miRNA-200家族在人類腫瘤中的研究進展[J];腫瘤防治研究;2012年04期

2 成榮杰;范艷艷;付艷;;上皮-間質轉化與婦科惡性腫瘤[J];國際婦產科學雜志;2012年01期

3 賀慧鵬;廖愛軍;;MicroRNA與腫瘤的研究進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學進展;2012年04期



本文編號:2347664

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