【摘要】：研究背景 卵巢癌是女性常見的生殖道惡性腫瘤之一,也是致死率最高的婦科惡性腫瘤,如何提高卵巢癌生存率仍然是當(dāng)今的世界性難題。在卵巢癌各種組織學(xué)類型中,上皮性卵巢癌最為常見,占90%以上。上皮性卵巢癌缺乏早期癥狀,75%的患者在初診時,腫瘤細(xì)胞已在腹腔內(nèi)廣泛播散。盡管手術(shù)理念的不斷更新和手術(shù)技巧的不斷提高,初次手術(shù)通常不能切凈晚期患者的全部轉(zhuǎn)移病灶。隨著新的化療藥物和方案的不斷更新,初次化療的緩解率不斷提高,但大多數(shù)晚期病人在完全緩解后2年左右復(fù)發(fā),復(fù)發(fā)性卵巢癌幾乎對所有化療藥物耐藥。所以,尋找上皮性卵巢癌進(jìn)展及耐藥相關(guān)的標(biāo)志物,對揭示上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展本質(zhì),和發(fā)現(xiàn)可用于早期診斷和預(yù)后預(yù)測的標(biāo)志物及逆轉(zhuǎn)耐藥的有效靶點均具有重要的意義。 自1948年人類發(fā)現(xiàn)第一個腫瘤標(biāo)志物以來,腫瘤標(biāo)志物的研究和應(yīng)用進(jìn)展迅速。但對上皮性卵巢癌而言,迄今為止發(fā)現(xiàn)的各種腫瘤標(biāo)志物,如CA125、CA199、 CA153、HE4等,對上皮性卵巢癌的診斷、治療反應(yīng)評價、預(yù)后評估與復(fù)發(fā)耐藥監(jiān)測及篩查有一定的幫助,但其特異性和敏感性仍然有限。20世紀(jì)90年代中期出現(xiàn)了一門新興學(xué)科：蛋白質(zhì)組學(xué)。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),可以分析不同條件下蛋白質(zhì)的差異表達(dá),從而研究生命的現(xiàn)象。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)越來越多地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究。許多疾病包括癌癥,已被認(rèn)為是蛋白質(zhì)組的疾病。蛋白組學(xué)為尋找疾病特別是癌癥的分子標(biāo)記物提供了有效方法。 隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中存在一群特殊類型的細(xì)胞,即腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell, CSC)。腫瘤干細(xì)胞最早于20世紀(jì)70年代在血液系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn)。此后,在包括卵巢癌在內(nèi)的許多實體瘤中都證實了腫瘤干細(xì)胞的存在。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多潛能分化的能力,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著決定性的作用,也是腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的根源。更重要的是,腫瘤干細(xì)胞對化療藥物天然耐藥�，F(xiàn)有的化療藥物,殺死的其實是普通腫瘤細(xì)胞,而對腫瘤干細(xì)胞基本無效。了解腫瘤干細(xì)胞的蛋白表達(dá)特征,對探索以針對腫瘤干細(xì)胞為靶點的治療新策略具有重要意義。我們在前期研究中,以上皮性卵巢癌細(xì)胞系3AO作為研究模型,采用無血清培養(yǎng)基的方法成功分離并鑒定出了卵巢癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(ovarian cancer stem cell-like cells, OCSC-LCs),發(fā)現(xiàn)其高表達(dá)公認(rèn)的干細(xì)胞相關(guān)基因Notch2, Sox2等,并具有CD24-的細(xì)胞表面標(biāo)記,與此同時,還證實了CD24-細(xì)胞對紫杉醇和順鉑均顯著耐藥。我們前期對卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的成功分離與鑒定,為后續(xù)研究打下了堅實的基礎(chǔ)。 本研究首先利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),以親本卵巢癌細(xì)胞株為對照,分別對卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞和卵巢癌耐藥細(xì)胞篩選差異表達(dá)蛋白,并進(jìn)行信息學(xué)分析；然后選擇4個顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì),在細(xì)胞水平進(jìn)行western blot驗證；最后選取UTP23蛋白,通過免疫組化在組織水平驗證UTP23異常表達(dá)及其與卵巢癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。旨在發(fā)現(xiàn)可用于上皮性卵巢癌診斷和預(yù)后預(yù)測的標(biāo)志物或耐藥逆轉(zhuǎn)的靶點,為探索卵巢癌診治新策略提供新路徑。 第一部分卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞和耐紫杉醇細(xì)胞與親本細(xì)胞差異表達(dá)蛋白的分離和鑒定 目的：分離和鑒定卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞和耐紫杉醇細(xì)胞與它們的親本卵巢癌細(xì)胞之間的差異表達(dá)蛋白,從而尋找與卵巢癌發(fā)生發(fā)展及耐藥可能相關(guān)的分子標(biāo)記物。 方法：對上皮性卵巢癌細(xì)胞3AO采用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)獲取卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。對上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3采用低劑量紫杉醇持續(xù)作用法獲取耐紫杉醇卵巢癌細(xì)胞(SKOV3-TR30).分別采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析和DIGE熒光差異凝膠電泳技術(shù)篩選卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞和耐紫杉醇細(xì)胞與親本細(xì)胞間的差異蛋白表達(dá)。采用Gene ontology分析進(jìn)行蛋白功能歸類和KEGG法進(jìn)行信號通路分析。 結(jié)果： 1.非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析 (1)在耐紫杉醇SKOV3-TR30和非耐藥SKOV3細(xì)胞中,共鑒定到5016個肽段,558個蛋白質(zhì)。差異顯著的356個蛋白中,上調(diào)蛋白47個,下調(diào)蛋白309個。 (2)在卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞與3AO細(xì)胞中,共鑒定到3601個肽段,431個蛋白質(zhì),差異顯著的187個蛋白中,上調(diào)蛋白質(zhì)72個,下調(diào)蛋白質(zhì)115個。 2. Gene ontology分析 (1)在耐紫杉醇SKOV3-TR與親本SKOV3的差異蛋白中,主要涉及代謝(35%)、生物過程調(diào)節(jié)(24%)、運送(13%)等。 (2)在卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞與3AO細(xì)胞的差異蛋白中,主要涉及代謝(20%),生物過程調(diào)節(jié)(12%),細(xì)胞成分組織(9%)等。 3. KEGG分析 在耐紫杉醇SKOV3-TR與親本SKOV3細(xì)胞和卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞與3AO細(xì)胞的差異蛋白中,通路的富集程度均沒有顯著差異。 4. DIGE分析 卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞與親本細(xì)胞之間存在217個差異表達(dá)蛋白,在耐紫杉醇和非耐紫杉醇細(xì)胞之間存在225個差異表達(dá)蛋白。 結(jié)論： 1.通過非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測和熒光差異雙向電泳技術(shù)檢測,分別在卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞與親本細(xì)胞之間、耐紫杉醇和非耐紫杉醇細(xì)胞之間存在多個差異表達(dá)蛋白質(zhì)。 2.存在于卵巢癌干細(xì)胞和耐紫杉醇細(xì)胞中的差異表達(dá)蛋白,主要涉及細(xì)胞代謝、生物過程調(diào)節(jié)、運送、分化等。 第二部分差異表達(dá)蛋白的驗證 目的：選擇部分差異表達(dá)蛋白,驗證蛋白質(zhì)組學(xué)檢測的正確性,為下一步的研究打下基礎(chǔ)。 方法：采用Western blot方法,檢測3個下調(diào)蛋白質(zhì)(UTP23、FLNA、HDGFRP3)和1個上調(diào)蛋白質(zhì)(ALDOC)分別在SKOV3/SKOV3-TR30、A2780/AT2780、3AO/3AO-SPH三對卵巢癌細(xì)胞株中的表達(dá)。 結(jié)果： 1.UTP23蛋白與SKOV3. A2780、3A0細(xì)胞相比,在SKOV3-TR30、AT2780、3AO-SPH中表達(dá)顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01,p0.001,p0.05),結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)一致。 2. FLNA蛋白與SKOV3、A2780/3A0細(xì)胞相比,在SKOV3-TR30、AT2780、3A0-SPH中表達(dá)顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.005,P0.001,P0.05),結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)一致。 3. HDGFRP3蛋白與親本細(xì)胞相比,在卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞和耐紫杉醇細(xì)胞中的表達(dá)僅部分結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)一致。 4. ALDOC蛋白與SKOV3、A2780.3A0細(xì)胞相比,在SKOV3-TR30、3AO-SPH中表達(dá)顯著下調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01,P0.01)；在AT2780中表達(dá)下調(diào),無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.113),均與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果不一致。 結(jié)論： 1.UTP23和FLNA蛋白在卵巢癌干細(xì)胞樣細(xì)胞和耐紫杉醇細(xì)胞中低表達(dá),提示兩者可作為候選卵巢癌抑癌基因,可能與維持卵巢癌干細(xì)胞特征和紫杉醇耐藥有關(guān)。 2. HDGFRP3和ALDOC表達(dá)與蛋白質(zhì)組學(xué)不完全一致,兩者在卵巢癌中的作用有待進(jìn)一步研究。 第三部分UTP23在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及臨床意義 目的：通過分析UTP23蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系,以評估UTP23在用于上皮性卵巢癌標(biāo)記物及藥物靶點方面可能的潛在價值。 方法：采用免疫組化方法對145例上皮性卵巢癌組織進(jìn)行UTP23蛋白表達(dá)測定,并分析UTP23蛋白表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系,包括：年齡、初次手術(shù)情況、FIGO分期、病理分級、腹水量、術(shù)前血清CA125、化療反應(yīng)、無瘤生存期(PFS)及總生存期(OS)。 結(jié)果： 1.UTP23蛋白表達(dá)于上皮性卵巢癌細(xì)胞的胞漿中,呈棕黃色顆粒染色。 2.單因素分析顯示：UTP23低表達(dá)與高FIGO分期、高病理分級、不滿意初次手術(shù)及CA125水平500U/L顯著相關(guān)(P0.05)；與化療敏感者相比,耐藥者的UTP23表達(dá)更低(P0.05)。 3.單因素分析顯示,UTP23表達(dá)與患者總生存期(x2=4.548,P=0.033)和無瘤生存期(x2=3.913,P=0.048)顯著性相關(guān),表達(dá)越低,生存期越短。 結(jié)論： 1.上皮性卵巢癌細(xì)胞表達(dá)UTP23,定位于胞漿。 2.化療耐藥者UTP23表達(dá)顯著低于化療敏感者,提示UTP23可能參與上皮性卵巢癌化療耐藥。 3.UTP23低表達(dá)與上皮性卵巢癌不良預(yù)后相關(guān),提示檢測UTP23表達(dá)可能可用于預(yù)測上皮性卵巢癌患者預(yù)后。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2329704