【摘要】：研究背景 卵巢癌是女性常見的生殖道惡性腫瘤之一,也是致死率最高的婦科惡性腫瘤,如何提高卵巢癌生存率仍然是當今的世界性難題。在卵巢癌各種組織學類型中,上皮性卵巢癌最為常見,占90%以上。上皮性卵巢癌缺乏早期癥狀,75%的患者在初診時,腫瘤細胞已在腹腔內廣泛播散。盡管手術理念的不斷更新和手術技巧的不斷提高,初次手術通常不能切凈晚期患者的全部轉移病灶。隨著新的化療藥物和方案的不斷更新,初次化療的緩解率不斷提高,但大多數(shù)晚期病人在完全緩解后2年左右復發(fā),復發(fā)性卵巢癌幾乎對所有化療藥物耐藥。所以,尋找上皮性卵巢癌進展及耐藥相關的標志物,對揭示上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展本質,和發(fā)現(xiàn)可用于早期診斷和預后預測的標志物及逆轉耐藥的有效靶點均具有重要的意義。 自1948年人類發(fā)現(xiàn)第一個腫瘤標志物以來,腫瘤標志物的研究和應用進展迅速。但對上皮性卵巢癌而言,迄今為止發(fā)現(xiàn)的各種腫瘤標志物,如CA125、CA199、 CA153、HE4等,對上皮性卵巢癌的診斷、治療反應評價、預后評估與復發(fā)耐藥監(jiān)測及篩查有一定的幫助,但其特異性和敏感性仍然有限。20世紀90年代中期出現(xiàn)了一門新興學科：蛋白質組學。利用蛋白質組學技術,可以分析不同條件下蛋白質的差異表達,從而研究生命的現(xiàn)象。蛋白質組學技術越來越多地應用于醫(yī)學研究。許多疾病包括癌癥,已被認為是蛋白質組的疾病。蛋白組學為尋找疾病特別是癌癥的分子標記物提供了有效方法。 隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中存在一群特殊類型的細胞,即腫瘤干細胞(cancer stem cell, CSC)。腫瘤干細胞最早于20世紀70年代在血液系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn)。此后,在包括卵巢癌在內的許多實體瘤中都證實了腫瘤干細胞的存在。腫瘤干細胞具有自我更新和多潛能分化的能力,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著決定性的作用,也是腫瘤轉移、復發(fā)的根源。更重要的是,腫瘤干細胞對化療藥物天然耐藥�，F(xiàn)有的化療藥物,殺死的其實是普通腫瘤細胞,而對腫瘤干細胞基本無效。了解腫瘤干細胞的蛋白表達特征,對探索以針對腫瘤干細胞為靶點的治療新策略具有重要意義。我們在前期研究中,以上皮性卵巢癌細胞系3AO作為研究模型,采用無血清培養(yǎng)基的方法成功分離并鑒定出了卵巢癌腫瘤干細胞樣細胞(ovarian cancer stem cell-like cells, OCSC-LCs),發(fā)現(xiàn)其高表達公認的干細胞相關基因Notch2, Sox2等,并具有CD24-的細胞表面標記,與此同時,還證實了CD24-細胞對紫杉醇和順鉑均顯著耐藥。我們前期對卵巢癌干細胞樣細胞的成功分離與鑒定,為后續(xù)研究打下了堅實的基礎。 本研究首先利用蛋白質組學技術,以親本卵巢癌細胞株為對照,分別對卵巢癌干細胞樣細胞和卵巢癌耐藥細胞篩選差異表達蛋白,并進行信息學分析；然后選擇4個顯著差異表達的蛋白質,在細胞水平進行western blot驗證；最后選取UTP23蛋白,通過免疫組化在組織水平驗證UTP23異常表達及其與卵巢癌臨床病理特征及預后的相關性。旨在發(fā)現(xiàn)可用于上皮性卵巢癌診斷和預后預測的標志物或耐藥逆轉的靶點,為探索卵巢癌診治新策略提供新路徑。 第一部分卵巢癌干細胞樣細胞和耐紫杉醇細胞與親本細胞差異表達蛋白的分離和鑒定 目的：分離和鑒定卵巢癌干細胞樣細胞和耐紫杉醇細胞與它們的親本卵巢癌細胞之間的差異表達蛋白,從而尋找與卵巢癌發(fā)生發(fā)展及耐藥可能相關的分子標記物。 方法：對上皮性卵巢癌細胞3AO采用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)獲取卵巢癌干細胞樣細胞。對上皮性卵巢癌細胞SKOV3采用低劑量紫杉醇持續(xù)作用法獲取耐紫杉醇卵巢癌細胞(SKOV3-TR30).分別采用非標記定量蛋白質組學分析和DIGE熒光差異凝膠電泳技術篩選卵巢癌干細胞樣細胞和耐紫杉醇細胞與親本細胞間的差異蛋白表達。采用Gene ontology分析進行蛋白功能歸類和KEGG法進行信號通路分析。 結果： 1.非標記定量蛋白質組學分析 (1)在耐紫杉醇SKOV3-TR30和非耐藥SKOV3細胞中,共鑒定到5016個肽段,558個蛋白質。差異顯著的356個蛋白中,上調蛋白47個,下調蛋白309個。 (2)在卵巢癌干細胞樣細胞與3AO細胞中,共鑒定到3601個肽段,431個蛋白質,差異顯著的187個蛋白中,上調蛋白質72個,下調蛋白質115個。 2. Gene ontology分析 (1)在耐紫杉醇SKOV3-TR與親本SKOV3的差異蛋白中,主要涉及代謝(35%)、生物過程調節(jié)(24%)、運送(13%)等。 (2)在卵巢癌干細胞樣細胞與3AO細胞的差異蛋白中,主要涉及代謝(20%),生物過程調節(jié)(12%),細胞成分組織(9%)等。 3. KEGG分析 在耐紫杉醇SKOV3-TR與親本SKOV3細胞和卵巢癌干細胞樣細胞與3AO細胞的差異蛋白中,通路的富集程度均沒有顯著差異。 4. DIGE分析 卵巢癌干細胞樣細胞與親本細胞之間存在217個差異表達蛋白,在耐紫杉醇和非耐紫杉醇細胞之間存在225個差異表達蛋白。 結論： 1.通過非標記定量蛋白質組學技術檢測和熒光差異雙向電泳技術檢測,分別在卵巢癌干細胞樣細胞與親本細胞之間、耐紫杉醇和非耐紫杉醇細胞之間存在多個差異表達蛋白質。 2.存在于卵巢癌干細胞和耐紫杉醇細胞中的差異表達蛋白,主要涉及細胞代謝、生物過程調節(jié)、運送、分化等。 第二部分差異表達蛋白的驗證 目的：選擇部分差異表達蛋白,驗證蛋白質組學檢測的正確性,為下一步的研究打下基礎。 方法：采用Western blot方法,檢測3個下調蛋白質(UTP23、FLNA、HDGFRP3)和1個上調蛋白質(ALDOC)分別在SKOV3/SKOV3-TR30、A2780/AT2780、3AO/3AO-SPH三對卵巢癌細胞株中的表達。 結果： 1.UTP23蛋白與SKOV3. A2780、3A0細胞相比,在SKOV3-TR30、AT2780、3AO-SPH中表達顯著下調,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01,p0.001,p0.05),結果與蛋白質組學一致。 2. FLNA蛋白與SKOV3、A2780/3A0細胞相比,在SKOV3-TR30、AT2780、3A0-SPH中表達顯著下調,差異有統(tǒng)計學意義(P0.005,P0.001,P0.05),結果與蛋白質組學一致。 3. HDGFRP3蛋白與親本細胞相比,在卵巢癌干細胞樣細胞和耐紫杉醇細胞中的表達僅部分結果與蛋白質組學一致。 4. ALDOC蛋白與SKOV3、A2780.3A0細胞相比,在SKOV3-TR30、3AO-SPH中表達顯著下調,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01,P0.01)；在AT2780中表達下調,無統(tǒng)計學意義(P=0.113),均與蛋白質組學結果不一致。 結論： 1.UTP23和FLNA蛋白在卵巢癌干細胞樣細胞和耐紫杉醇細胞中低表達,提示兩者可作為候選卵巢癌抑癌基因,可能與維持卵巢癌干細胞特征和紫杉醇耐藥有關。 2. HDGFRP3和ALDOC表達與蛋白質組學不完全一致,兩者在卵巢癌中的作用有待進一步研究。 第三部分UTP23在上皮性卵巢癌組織中的表達及臨床意義 目的：通過分析UTP23蛋白在上皮性卵巢癌組織中的表達及其與臨床病理參數(shù)及預后的關系,以評估UTP23在用于上皮性卵巢癌標記物及藥物靶點方面可能的潛在價值。 方法：采用免疫組化方法對145例上皮性卵巢癌組織進行UTP23蛋白表達測定,并分析UTP23蛋白表達水平與臨床病理參數(shù)及預后的關系,包括：年齡、初次手術情況、FIGO分期、病理分級、腹水量、術前血清CA125、化療反應、無瘤生存期(PFS)及總生存期(OS)。 結果： 1.UTP23蛋白表達于上皮性卵巢癌細胞的胞漿中,呈棕黃色顆粒染色。 2.單因素分析顯示：UTP23低表達與高FIGO分期、高病理分級、不滿意初次手術及CA125水平500U/L顯著相關(P0.05)；與化療敏感者相比,耐藥者的UTP23表達更低(P0.05)。 3.單因素分析顯示,UTP23表達與患者總生存期(x2=4.548,P=0.033)和無瘤生存期(x2=3.913,P=0.048)顯著性相關,表達越低,生存期越短。 結論： 1.上皮性卵巢癌細胞表達UTP23,定位于胞漿。 2.化療耐藥者UTP23表達顯著低于化療敏感者,提示UTP23可能參與上皮性卵巢癌化療耐藥。 3.UTP23低表達與上皮性卵巢癌不良預后相關,提示檢測UTP23表達可能可用于預測上皮性卵巢癌患者預后。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 曾嶸,夏其昌;蛋白質組學研究進展與趨勢[J];中國科學院院刊;2002年03期

2 李林,吳家睿,李伯良;蛋白質組學的產生及其重要意義[J];生命科學;1999年02期

3 傅云峰;葉大風;陳懷增;呂衛(wèi)國;程琪;謝幸;;耐紫杉醇卵巢癌細胞亞系SKOV3-TR30的建立及特征[J];現(xiàn)代婦產科進展;2005年06期

4 馬袁君;程震龍;孫野青;;生物信息學及其在蛋白質組學中的應用[J];生物信息學;2008年01期

5 宋東穎;王毅;孫嵐;張英鴿;;腫瘤干細胞理論及腫瘤干細胞分離和鑒定研究進展[J];中國藥理學與毒理學雜志;2012年05期

，

本文編號：2329704