【摘要】：研究背景 卵巢癌是病死率最高的婦科惡性腫瘤,盡管在診斷和治療上已有很多改進(jìn),但仍然有75%卵巢癌患者在診斷時(shí)已屬晚期,五年生存率仍徘徊在30%。因此深入研究卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,對于提高卵巢癌的早期診斷、治療和改善預(yù)后具有重要意義。目前大多數(shù)研究都是著眼于與腫瘤細(xì)胞增殖、分化和代謝相關(guān)通路及過程,有mRNA加工在卵巢癌中的研究很少。：mRNA的加工是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的一個(gè)重要過程,3’端poly(A)尾是真核生物mRNA主要特征,在調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯中發(fā)揮重要作用,是調(diào)控基因表達(dá)的重要機(jī)制。在本研究中我們從mRNA加工出發(fā),著重研究mRNA可變加尾在卵巢癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮的作用,探索卵巢癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找與卵巢癌相關(guān)的基因,為臨床卵巢癌診斷和治療提供生物學(xué)基礎(chǔ)依據(jù)。 研究目的 1.優(yōu)化檢測poly(A)位點(diǎn)的PAS-Seq (PolyA Site-Sequencing)方法。 2.探討mRNA加尾位點(diǎn)在正常卵巢上皮細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞中的分布和差異。 3.探索引起卵巢癌細(xì)胞mRNA選擇性加尾變化的分子機(jī)理。4.探索3’端poly(A)尾加工因子CstF-2T表達(dá)異常在卵巢癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中的臨床意義。 研究方法 1.提取1株正常卵巢細(xì)胞和7株卵巢癌細(xì)胞系中的細(xì)胞總RNA,并對總RNA進(jìn)行質(zhì)檢,通過純化出mRNA并將其片段化,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄,引入接頭,擴(kuò)增和回收片段等步驟,構(gòu)建DNA測序文庫,常規(guī)測序驗(yàn)證文庫質(zhì)量。 2.采用高通量測序,鑒定卵巢癌細(xì)胞中特異的poly(A)加尾位點(diǎn)變化。 3.Westernblot方法檢測CstF-2T蛋白在正常卵巢細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的表達(dá)水平。 4.采用PAS-Seq方法比較在卵巢癌細(xì)胞shRNA沉默CstF-2T前后,細(xì)胞mRNA選擇性加尾變化,探討卵巢癌細(xì)胞中CstF-2T蛋白表達(dá)對mRNA poly(A)位點(diǎn)選擇的影響。 5.采用免疫組織化學(xué)方法,檢測CstF-2T蛋白在正常卵巢上皮、卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌原發(fā)灶、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和復(fù)發(fā)灶的表達(dá)情況。研究結(jié)果 1.RNA經(jīng)定量和電泳檢測,質(zhì)量符合PAS-Seq實(shí)驗(yàn)要求,DNA文庫制備的各項(xiàng)參數(shù)達(dá)達(dá)到測序上機(jī)要求,文庫制備成功。 2.APA在卵巢細(xì)胞中發(fā)生的頻率較高,大約有30%的基因在卵巢細(xì)胞中含有2個(gè)poly(A)位點(diǎn),部分基因含有更多的poly(A)位點(diǎn)。與正常卵巢相比,有APA的基因與卵巢癌細(xì)胞增殖、粘附、血管形成等生物學(xué)特性有關(guān)。 3.CstF-2T蛋白在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常卵巢細(xì)胞。 4.在卵巢癌細(xì)胞中shRNA沉默CstF-2T后,基因mRNA poly(A)尾位點(diǎn)發(fā)生改變,有poly(A)位點(diǎn)變化的基因參與PI3K/Akt、MAPK和Wnt等與腫瘤密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。 5.CstF-2T蛋白在卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌中的表達(dá)水平明顯高于正常卵巢組織,并且CstF-2T蛋白在卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌復(fù)發(fā)病灶中的表達(dá)高于原發(fā)病灶。 結(jié)論 1.成功地優(yōu)化了檢測poly(A)位點(diǎn)的PAS-Seq方法。PAS-Seq方法可以從全基因組水平大通量地分析mRNA poly(lA)加尾位點(diǎn)的轉(zhuǎn)換,為開展鑒定卵巢癌特異lnRNA選擇性加尾事件和開展后續(xù)機(jī)理研究提供重要的保證。 2.我們獲得了正常卵巢細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞中mRNA poly(A)加尾譜,在細(xì)胞水平上根據(jù)mRNA選擇性加尾位點(diǎn)不同進(jìn)行了聚類分析。Poly(A)位點(diǎn)選擇的差異能夠有效地識(shí)別卵巢癌細(xì)胞和正常卵巢細(xì)胞,并且為卵巢癌細(xì)胞亞型分類提供了一個(gè)潛在的指標(biāo)。 3.在卵巢癌細(xì)胞系ES2、SKOV3和IGROV1中鑒定受CstF-2T調(diào)控的mRNApoly(A)位點(diǎn),為后續(xù)理解卵巢癌細(xì)胞mRNA加尾變化的分子機(jī)理提供重要信息。 4.CstF-2T蛋白在卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌復(fù)發(fā)病灶中的表達(dá)水平高于原發(fā)病灶,有可能作為在卵巢癌復(fù)發(fā)過程中出現(xiàn)的腫瘤異質(zhì)性分子指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.31

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本文編號(hào)：2325791