【摘要】：目的：通過對上皮性卵巢癌組織和細胞的體內外實驗研究，探討細胞骨架蛋白MICAL-L2及其相互作用蛋白α-輔肌蛋白4（ACTN4）在卵巢癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移中的作用及可能機制。 方法：（1）用免疫組化法檢測人上皮性卵巢癌組織芯片中MICAL-L2蛋白的表達，探討MICAL-L2與人卵巢癌臨床病理特征之間的關系。（2）利用慢病毒轉染技術構建穩(wěn)定干擾MICAL-L2的人卵巢癌細胞株，采用CCK8方法、劃痕實驗、空穿實驗、膠穿實驗等方法檢測干擾MICAL-L2后對細胞增殖，遷移及侵襲功能的影響。（3）利用細胞免疫熒光技術檢測干擾MICAL-L2后細胞形態(tài)變化及EMT相關分子標志物的變化。（4）利用western blotting方法檢測EMT相關分子標志物及下游通路中相關分子在干擾MICAL-L2組和對照組中的變化情況。（5）利用RT-PCR方法檢測EMT過程中相關轉錄因子的變化。（6）利用熒光素酶報告基因檢測Wnt通路中TOP/FOP的活性變化情況。（7）利用RT-PCR方法及siRNA干擾方法初步驗證MICAL-L2與ACTN4的相互作用關系。（8）利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析ACTN4與卵巢癌預后之間的關系。（9）利用MTT和流式細胞術的方法分析ACTN4與卵巢癌耐藥的關系及可能機制。 結果：（1）MICAL-L2在上皮性卵巢癌中的高表達率（68.60%）明顯高于正常對照組（16.67%），差異有顯著性（P0.0001）。MICAL-L2在卵巢癌III-IV期中的高表達率（81.40%）顯著高于I-II期（55.81%）（P=0.011）；在組織學分級為G2、G3中的高表達率顯著高于G1期（P=0.009）。（2）穩(wěn)定干擾MICAL-L2基因后，與對照組比較，細胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯減弱，差異有顯著性（p值均＜0.01）。(3)細胞免疫熒光檢測F-actin、上皮分子標志物E-cadherin、間質分子標志物vimentin發(fā)現(xiàn)，干擾穩(wěn)定MICAL-L2后細胞形態(tài)發(fā)生重要變化，由梭形變?yōu)閳A形，細胞與細胞間連接更加緊密，，上皮分子標志物E-cadherin明顯增多，間質分子標志物vimentin表達明顯下降。（4）western blotting結果顯示：上皮分子標志物E-cadherin表達升高，間質分子標志物vimentin表達明顯下降，胞核中β-catenin表達明顯降低，胞漿中無變化，p-β-catenin無變化，Wnt/β-catenin通路下游Cyclin-D1表達降低。(5) RT-PCR方法檢測EMT轉錄因子SNAIL、SLUG、TWIST、ZEB1和ZEB2在干擾MICAL-L2組和對照組變化，結果顯示干擾MICAL-L2后SNAIL和SLUG無變化，TWIST、ZEB1和ZEB2在mRNA水平表達明顯降低且有統(tǒng)計學意義（P0.05）。（6）TOP/FOP熒光素酶報告基因檢測Wnt通路中轉錄活性的變化，結果顯示干擾MICAL-L2后TOP活性較對照組明顯降低，F(xiàn)OP活性無明顯變化。（7）RT-PCR方法及siRNA干擾方法分析MICAL-L2與ACTN4的關系，結果發(fā)現(xiàn)在高表達MICAL-L2的細胞株中ACTN4表達也相應較高，瞬時干擾MICAL-L2后ACTN4表達也明顯降低（8）TCGA數(shù)據(jù)庫分析ACTN4與卵巢癌患者預后明顯相關，ACTN4基因改變的患者預后較差，且有統(tǒng)計學意義（P0.01）。(9)轉染ACTN4-siRNA的卵巢癌細胞對化療藥紫杉醇敏感性增加（P＜0.05)，凋亡率增加（P＜0.05)。 結論： 1、卵巢癌組織中MICAL-L2高表達與卵巢癌臨床分期和組織學分級有關。 2、MCIAL-L2可促進卵巢癌細胞的增殖，遷移和侵襲。 3、MICAL-L2能促進卵巢癌細胞EMT的發(fā)生。 4、激活經典的Wnt/β-catenin通路以及促進Rac1的活化可能是MICAL-L2引起卵巢癌細胞EMT的發(fā)生的機制之一 5、ACTN4與卵巢癌不良預后關系密切，其可能通過抑制卵巢癌細胞的凋亡參與對紫杉醇的化療抵抗。 6、抑制MCIAL-L2和ACTN4將為卵巢癌的臨床治療提供一個新的靶點。
[Abstract]:Objective: To investigate the role of cytoskeleton protein MICAL-L2 and its interacting protein alpha-comyosin 4 (ACTN4) in the development, invasion and metastasis of epithelial ovarian cancer (EOC) in vitro and in vivo.
Methods: (1) The expression of MICAL-L2 protein in human epithelial ovarian cancer tissue microarray was detected by immunohistochemistry, and the relationship between MICAL-L2 and clinicopathological characteristics of human ovarian cancer was studied. (2) The human ovarian cancer cell line stably interfering with MICAL-L2 was constructed by lentivirus transfection technique. CCK8 method, scratch test, empty puncture test and adhesive puncture test were used. Methods The effects of interfering with MICAL-L2 on cell proliferation, migration and invasion were examined. (3) Cell morphology and EMT-related molecular markers were detected by immunofluorescence assay. (4) EMT-related molecular markers and related molecules in downstream pathway were detected by Western blotting. (6) The activity of TOP/FOP in Wnt pathway was detected by luciferase reporter gene. (7) The interaction between MICAL-L2 and ACTN4 was preliminarily verified by RT-PCR and siRNA interference. (8) The interaction between MICAL-L2 and ACTN4 was analyzed by TCGA database. The relationship between TN4 and the prognosis of ovarian cancer. (9) The relationship between ACTN4 and drug resistance in ovarian cancer was analyzed by MTT and flow cytometry.
Results: (1) The high expression rate of MICAL-L2 in epithelial ovarian cancer (68.60%) was significantly higher than that in normal control group (16.67%). The high expression rate of MICAL-L2 in ovarian cancer stage III-IV (81.40%) was significantly higher than that in stage I-II (55.81%) (P = 0.011); the high expression rate in histological grade G2 and G3 was significantly higher than that in stage G1 (P = 0.009). After stably interfering with MICAL-L2 gene, the proliferation, migration and invasiveness of the cells were significantly decreased compared with the control group (p < 0.01). (3) F-actin, E-cadherin and vimentin were detected by immunofluorescence, and the morphology of the cells was significantly changed after interfering with the stabilization of MICAL-L2. The results of Western blotting showed that the expression of E-cadherin increased, the expression of vimentin decreased, the expression of vimentin decreased and the expression of E-cadherin decreased. The expression of Cyclin-D1 in the downstream of Wnt/beta-catenin pathway was decreased. (5) The expression of SNAIL, SLUG, TWIST, ZEB1 and ZEB2 in the interfering MICAL-L2 group and control group was detected by RT-PCR. The results showed that SNAIL and SLUG did not change after interfering with MICAL-L2, and the expression of TWIST, ZEB1 and ZEB2 decreased significantly at mRNA level. Low and statistically significant (P 0.05). (6) TOP / FOP luciferase reporter gene detection of Wnt pathway transcriptional activity, the results showed that after interfering with MICAL-L2, TOP activity was significantly lower than the control group, FOP activity was not significantly changed. (7) RT-PCR and siRNA interference analysis of the relationship between MICAL-L2 and ACTN4, the results showed that the high expression of MICAL-L2 fine. The expression of ACTN4 was also higher in the cell lines, and the expression of ACTN4 was significantly lower after transient interference with MICAL-L2. (8) TCGA database analysis showed that ACTN4 was significantly correlated with the prognosis of ovarian cancer patients, and the prognosis of patients with ACTN4 gene change was poor, and there was statistical significance (P 0.01). (9) The sensitivity of ovarian cancer cells transfected with ACTN4-siRNA to paclitaxel increased (P < 0.0). 5) apoptosis rate increased (P < 0.05).
Conclusion:
1, the high expression of MICAL-L2 in ovarian cancer is related to the clinical stage and histological grading of ovarian cancer.
2, MCIAL-L2 can promote the proliferation, migration and invasion of ovarian cancer cells.
3, MICAL-L2 can promote the occurrence of EMT in ovarian cancer cells.
4. Activating the classical Wnt/beta-catenin pathway and promoting the activation of Rac1 may be one of the mechanisms of EMT induced by MICAL-L2 in ovarian cancer cells.
5. ACTN4 is closely related to the poor prognosis of ovarian cancer. It may participate in the chemotherapeutic resistance to paclitaxel by inhibiting the apoptosis of ovarian cancer cells.
6, inhibition of MCIAL-L2 and ACTN4 will provide a new target for clinical treatment of ovarian cancer.
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R737.31

【共引文獻】

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3 ;Association between phospholipase C epsilon gene(PLCE1)polymorphism and colorectal cancer risk in a Chinese population[A];2013年浙江省肛腸外科學術年會暨結直腸疾病的微創(chuàng)及綜合治療新進展學習班論文匯編[C];2013年

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本文編號：2242409