本文選題：環(huán)孢素A　切入點(diǎn)：胚胎著床　出處：《復(fù)旦大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：體外受精-胚胎移植技術(shù)在不孕癥治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。但是胚胎低著床率仍然是技術(shù)的瓶頸,提高臨床受孕率是目前理論及技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。胚胎成功著床取決于母體子宮內(nèi)膜和胚胎兩方面因素。胚胎方面,TB的生物學(xué)功能和行為是關(guān)鍵性作用。CsA是用于器官移植和自身免疫疾病的免疫抑制藥物,促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖功能。對人類早期妊娠研究證實(shí),CsA在誘導(dǎo)母體對胚胎抗原產(chǎn)生免疫耐受的同時(shí),促進(jìn)妊娠50-60天的絨毛TB增生和侵襲,減少其凋亡；在小鼠流產(chǎn)模型中觀察到,CsA降低CBA/JxDBA/2小鼠的胚胎吸收率。進(jìn)一步研究證明,CsA主要與環(huán)親素結(jié)合,通過MAPK3/MAPK1/AP1信號通路及Ca2+/calcineurin/NFAT信號傳導(dǎo)路徑發(fā)揮作用。胚胎與子宮內(nèi)膜的發(fā)育同步是胚胎被子宮內(nèi)膜接受和成功著床的先決條件。關(guān)于CsA對胚胎的作用我們尚不清楚：CsA是否通過改善圍著床胚胎TB的功能,提高胚胎著床率,從而有利于IVF-ET? CsA是否對植入前胚胎的發(fā)育構(gòu)成影響,改變胚胎發(fā)育速度而影響胚胎著床?本課題通過以小鼠胚胎為模型,進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),研究CsA調(diào)節(jié)著床前小鼠胚胎發(fā)育與分化、胚胎粘附與侵襲的分子機(jī)制,以探索CsA對胚胎及其著床的影響。第一部分環(huán)孢素A對孵出前胚胎細(xì)胞增殖、凋亡、分化和囊胚形成的調(diào)節(jié)作用[目的]以小鼠為模型,探討CsA對孵出前胚胎的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化和BC形成的調(diào)節(jié)作用。[方法]①應(yīng)用含濃度為0、0.1、1.0和CsA的培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠2dpc胚胎,收集4dpc胚胎觀察細(xì)胞分化,應(yīng)用DAPI對全胚胎細(xì)胞核染色,應(yīng)用免疫熒光對ICM細(xì)胞染色,計(jì)算TB和cICM,以判斷BC細(xì)胞分化及細(xì)胞群落分布；②收集5dpc小鼠胚胎經(jīng)Hocehst 33258熒光染色后計(jì)數(shù)胚胎細(xì)胞數(shù)量,觀察BC形成；用TUNEL染色法,在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。采用RT-PCR技術(shù),分析不同濃度CsA對4dpc小鼠胚胎CDX2和Oct4 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。[結(jié)果]2754枚2dpc小鼠胚胎分為4組,分別經(jīng)含濃度為0、0.1、1和10μMCsA培養(yǎng)液培養(yǎng)。到5dpc BC形成率分別為68.1%(n=689)、67.5%(n=682)、66.4%(n=693)和68.4(n=690),各組間無顯著性差異(p0.05)。取2dpc胚胎經(jīng)濃度為0、0.1、1和lOpM CsA的培養(yǎng)液培養(yǎng)到5dpc后,獲得175枚3期及以上BC用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。各組每胚胎的細(xì)胞數(shù)為91.1±3.2(n=34)、 82.9±2.1(n=47)、88.5±3.0(n=45)和93.3±2.9(n=49),各組間沒有顯著性差異(P0.05)。取2dpc胚胎經(jīng)濃度為0、0.1、1和10μM CsA的培養(yǎng)液培養(yǎng)到4dpc后,獲得154枚3期及以上BC用于cICM和TB計(jì)數(shù)(0、0.1、1和10μM組分別有胚胎47、36、39和32)。各組每胚胎cICM數(shù)分別為10.6±0.5、12.3±0.7、12.3±0.6和12.2±0.7,TB數(shù)分別為38.6±1.3、40.5±1.8、42.1±1.9和45.0±2.7。各組問的cICM和TB沒有顯著性差異(P0.05)。以對照組(0μM組)的表達(dá)量為“1”,0、0.1、1和10μM CsA組的Oct4mRNA的轉(zhuǎn)錄分別為1.00±0.07、1.42±0.08、1.63±0.18和0.60±-0.07。1.0組顯著高于其他各組(P0.05),但當(dāng)CsA超過10μM時(shí)表達(dá)下調(diào)(P0.001)；CDX2mRNA的轉(zhuǎn)錄分別為1.00±0.24、1.10±0.13、1.14±0.22和0.77±0.17,各組間無顯著性差異(P0.05)。取2dpc胚胎經(jīng)濃度為0、0.1、1和10μM CsA的培養(yǎng)液培養(yǎng)到5dpc后,獲得97枚3期BC用TUNEL染色后計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞。0、0.1、1和10μM組胚胎的細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)分別為4.51±0.30、5.14±0.17、5.56±0.23和3.79±0.12。各組間無顯著性差異(p0.05)。[結(jié)論]由以上結(jié)果我們得出以下結(jié)論：1.在0.1-10μM濃度下,CsA在體外對5dpc小鼠BC形成和凋亡沒有顯著性影響。2.在0.1-10μM濃度下,CsA在體外對小鼠體外BC的細(xì)胞總數(shù)量(5dpc)、TB和cICM(4dpc)數(shù)量沒有影響。3.在0.1-1.0μM濃度下,CsA明顯上調(diào)cICM Oct4 mRNA的轉(zhuǎn)錄,但達(dá)到10gM后出現(xiàn)下調(diào)；對TB特異分子CDX2的mRNA轉(zhuǎn)錄沒有顯著影響。第二部分環(huán)孢素A調(diào)節(jié)小鼠囊胚孵出和著床能力的分子機(jī)制[目的]探索CsA對胚胎孵出和著床能力的調(diào)節(jié)和機(jī)制。[方法]①將小鼠2dpc胚胎培養(yǎng)到4dpc后,取出BC在濃度為0、0.1、1.0和10μM CsA的培養(yǎng)液培養(yǎng)到6dpc,觀察BC的孵出率,用RT-PCR檢測關(guān)鍵酶ISP1mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；②將小鼠2dpc胚胎培養(yǎng)到5dpc后,取出孵出的BC用濃度為0、0.1、1.0和10μM CsA的培養(yǎng)液、LN包被的培養(yǎng)皿培養(yǎng),在7dpc和8dpc分別觀察胚胎粘附率和測量伸展生長的面積。并應(yīng)用qRT-PR檢測itgβ3和MMP-9mRNA轉(zhuǎn)錄水平,并應(yīng)用免疫熒光技術(shù)在激光共聚焦顯微鏡觀察其蛋白表達(dá)。[結(jié)果]799個(gè)胚胎用于觀察胚胎孵出。0、0.1、1.0和IOμM CsA組的BC孵出率分別為90.15%(n=203)、89.57%(n=211)、96.25%(n=186)和95.98%(n=199),P0.05。以對照組(0μM組)的表達(dá)量為“1”,0、0.1、1和10μMCsA組的ISP1 mRNA的轉(zhuǎn)錄分別為1.00±0.31、0.68±0.13、0.73±0.18和1.01±0.33,各組間沒有顯著差異(P0.05)。360個(gè)胚胎用于觀察胚胎的粘附。0、0.1、1和10μM CsA組的粘附率分別為76.0%(n=79)、91.8%(n=97)、93.8%(n=80)和83.7%(n=104),0.1和1.0μM組明顯高于對照組(P0.01)。]26個(gè)粘附胚胎用于測量伸展面積。0、0.1、1和1OμM CsA組的胚胎伸展生長面積(×104μm2)分別為4.14±0.39(n=29)、4.32±0.37(n=34)、5.76±0.37(n=34)和4.83±0.34(n=29)。1μM組明顯高于對照組(P0.05)。以對照組(0μM組)的表達(dá)量為“1”,0、0.1、1和10μM CsA組的itgβ3 mRNA的轉(zhuǎn)錄分別為1.00±0.07、0.51±0.09、1.98±0.0.29和0.76±0.08,1μM組明顯高于對照組(P0.05)。MMP-9 mRNA的轉(zhuǎn)錄分別為1.00±0.15、1.44±0.18、2.37±0.18和1.68±0.21,0.1和1州組明顯高于對照組(P0.05)。免疫熒光顯示,itgβ3和MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)。[結(jié)論]由以上結(jié)果我們得出以下結(jié)論：1.CsA不影響胚胎的孵出及關(guān)鍵酶ISP1 mRNA的表達(dá)。2.胚胎孵出后,CsA在0.1和1.0μM濃度下明顯提高BC對LN的粘附；1.0μM濃度下促進(jìn)胚胎在LN上的伸展生長；其作用的分子機(jī)制可能與TB的整合素αvβ3和MMP-9在mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。小結(jié)1.在0.1-10μM濃度的CsA下,CsA不影響孵出前胚胎的發(fā)育進(jìn)程,包括細(xì)胞增殖、凋亡、BC形成不受影響,cICM和TB的分化不受影響。TB的CDX2表達(dá)不受影響,但cICM的Oct4表達(dá)受到上調(diào)。2.CsA可能通過上調(diào)整合素αvβ3的表達(dá),上調(diào)胚胎粘附和遷移的功能；通過上調(diào)MM-9的表達(dá),改善胚胎裂解ECM的功能,從而使胚胎TB的侵襲能力提高,有利于胚胎的著床。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R714.8

【參考文獻(xiàn)】

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1 胡寒,李尚為,孫燕;環(huán)孢素A對正常人早孕滋養(yǎng)層細(xì)胞IL-10和IFN-γ分泌的影響[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年01期

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3 閆鳳亭,李大金,孫曉溪,朱影,王明雁,孟毅,余江;環(huán)孢素A對正常早孕期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞體外生長的調(diào)節(jié)作用[J];中華婦產(chǎn)科雜志;2002年02期

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本文編號：1661488