發(fā)布時間：2018-03-16 22:46

  本文選題：AP3B1　切入點：雌性生殖　出處：《山東大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：受社會快速發(fā)展給人們生活環(huán)境帶來的負面影響,不孕不育的發(fā)病率越來越高,據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測,不孕不育癥將成為21世紀的第三大疾病,僅次于腫瘤和心腦血管病。在眾多的不孕不育患者中女性子宮發(fā)育不良是主要病因之一,且尚無有效的治療方法。我們的研究發(fā)現(xiàn)pearl (pe)雌鼠存在典型的幼稚子宮現(xiàn)象,可以作為研究子宮發(fā)育不良的動物模型。pe小鼠是AP3B1基因突變引起的HPSⅡ動物模型。HPS是一種常染色體隱性遺傳病,主要的臨床癥狀有肺部纖維化、出血、結(jié)腸炎等,目前在HPSⅡ病人和pe小鼠中尚無生殖能力下降的報道。 在本部分論文中,我們依次在整體、器官、以及細胞分子水平對pe小鼠的生殖系統(tǒng)進行了全面檢測,并對AP3B1基因?qū)е聀e雌鼠子宮發(fā)育不良的原因進行了深入探索。通過大規(guī)模交配實驗,我們發(fā)現(xiàn)：與對照組相比,pe雌鼠的產(chǎn)仔數(shù)顯著降低,受孕幾率略微降低。進一步通過對各個年齡段pe雌鼠進行器官組織水平分析,我們發(fā)現(xiàn)：當(dāng)發(fā)育到一個月時,pe雌鼠開始出現(xiàn)子宮發(fā)育不良的明顯特征,發(fā)育到三個月時pe雌鼠表現(xiàn)出顯著的幼稚子宮的特征；而在幼鼠時這一現(xiàn)象并不明顯。pe雌鼠的卵巢沒有明顯的發(fā)育異常,但其超排卵數(shù)量顯著降低,雌激素含量與B6相比沒有顯著差異。分子蛋白水平分析發(fā)現(xiàn)：pe雌鼠的子宮發(fā)育的關(guān)鍵基因Hoxa10、Hoxa11、Wnt5a表達明顯降低；Western Blot分析證實子宮發(fā)育過程重要的通路蛋白β-catenin在細胞質(zhì)中表達量顯著高于B6,在細胞膜上表達量顯著低于B6,我們認為受AP3B1基因突變影響,β-catenin的運輸過程發(fā)生障礙,導(dǎo)致其在細胞質(zhì)中大量積累。 綜上所述,pe雌鼠表現(xiàn)出明顯的子宮發(fā)育不良的特征,是研究幼稚子宮的良好的動物模型,AP3B1基因突變引起子宮發(fā)育不良的原因很可能是AP3蛋白復(fù)合體的缺失影響了PCP-2和β-catenin的膜質(zhì)定位,進而導(dǎo)致了子宮發(fā)育中重要的調(diào)控通路Wnt和Hox異常。對相關(guān)途徑的深入探究將加深我們對蛋白轉(zhuǎn)運的認識,同時可以為臨床不孕不育研究提供新的思路。 對基因組中特定位點進行修飾的實驗手段稱為基因組編輯。它在研究基因的功能和基因修復(fù)以及細胞替代治療上有廣泛的應(yīng)用前景。CRISPR-CAS9技術(shù)作為一門新興的基因修飾方法,憑借其眾多的優(yōu)勢正逐步成為傳統(tǒng)基因編輯方法強有力的替代者。2013年CRISPR-CAS9技術(shù)在小鼠基因定點敲除中得到了前所未有的普及和發(fā)展,本部分論文的目的在于搭建小鼠受精卵顯微注射平臺,并在此基礎(chǔ)上初步探索CRISPR-CAS9技術(shù)在小鼠基因定點敲除中的應(yīng)用。 小鼠受精卵顯微注射平臺主要由四部分組成,分別為受精卵的收集,受精卵的處理,受精卵的顯微注射和二細胞期胚胎移植。我們通過大量的重復(fù)實驗針對上述四個步驟摸索了一套合適的實驗條件,包括受精卵消化用的透明質(zhì)酸酶濃度最佳為0.3mg/ml,受精卵收集的時間設(shè)在下午13：00最合適,胚胎移植的假孕雌鼠品系最好用CD1。最終我們胚胎移植的多只CD1雌鼠成功生育,說明顯微注射平臺初步建設(shè)完成。 為了利用CRISPR-CAS9技術(shù)在我們建設(shè)的顯微注射平臺上進行小鼠基因敲除工作,我們選擇了附睪特異基因Teddml和serpina1f,由于時間關(guān)系,我們完成了上述基因的靶點設(shè)計工作,后續(xù)的gRNA的構(gòu)建和Cas9RNA的制備工作正在進行中。相信在未來CRISPR/Cas技術(shù)會在基因修飾領(lǐng)域得到全面的發(fā)展,并有效地推動基因功能的研究進程。
[Abstract]:By the rapid development of society and brings negative influences to the living environment of people, the incidence of infertility is more and more high, according to WHO, infertility will become the third largest disease in twenty-first Century, after cancer and cardiovascular disease. In many infertile women with infertile patients with uterine dysplasia is one of the main reason, and there is no effective treatment method. We found that Pearl (PE) female rats are a typical phenomenon of infantile uterus, animal model of.Pe mice can be used to study the uterine dysplasia is caused by mutations in the AP3B1 gene HPS II animal model.HPS is an autosomal recessive genetic disease, the main clinical symptoms of pulmonary fibrosis, bleeding, colitis. At present in the HPS II patients and PE mice have decreased reproductive capacity is reported.
In this part, we turn on the whole, organ, cell and molecular level and reproductive system of PE mice conducted a comprehensive inspection, and the AP3B1 gene causes uterine dysplasia PE female rats were deeply explored. Through large-scale mating experiments, we found that: compared with the control group, number of litter PE female rats the lower the chances of pregnancy decreased slightly. Through further analysis, the level of organs and tissues of all ages PE female rats we found that when the development of a month, PE female rats began to appear obvious features of hypoplasia of uterus, development to three months PE female rats showed significant features of infantile uterus in; this phenomenon is not obvious when the rats.Pe female rats ovary had no obvious abnormalities, but the superovulation quantity decreased, estrogen content had no significant difference compared with B6. Molecular analysis of protein level Found: key genes Hoxa10, PE female mice uterus Hoxa11, Wnt5a expression decreased significantly; Western Blot analysis confirmed the expression of -catenin protein beta pathway important developmental processes in the cytoplasm of uterine volume was significantly higher than that of B6, the expression of B6 was significantly lower than in the cell membrane, we believe the impact of AP3B1 gene mutation, the transport process of beta the occurrence of -catenin disorder, lead to the accumulation in the cytoplasm.
In conclusion, PE female rats showed obvious features of hypoplasia of uterus, is a good animal model for the study of infantile uterus, AP3B1 gene mutation causes uterine dysplasia is likely to lack AP3 protein complexes influence membrane localization of PCP-2 and beta -catenin, which led to the development of uterus in important regulatory pathway of Wnt and the Hox anomaly. On way of in-depth study will deepen our understanding of the protein transport, and can provide new ideas for clinical infertility research.
The specific points in the genome of experimental method called modified genome editing. It in the study of gene function and gene repair and cell replacement therapy has broad application prospect of.CRISPR-CAS9 technology as a new gene modified method, with its many advantages are gradually become a traditional gene editing method strong substitute.2013 CRISPR-CAS9 gene knockout mouse technology in point has been the development and popularization of hitherto unknown, the purpose of this paper is to build a mouse zygotes microinjection platform, and on the basis of preliminary exploration of CRISPR-CAS9 technology in gene knockout mice designated in the application.
Mouse zygotes microinjection system consists of four parts, respectively, the fertilized egg collection, processing of fertilized eggs, microinjection of fertilized eggs and two cell stage embryos. We through a lot of experiments according to the above four steps to explore a set of suitable experimental conditions, including the fertilized egg is digested with transparent hyaluronidase optimum concentration is 0.3mg/ml, the fertilized egg collection time at 13:00 in the afternoon the most appropriate, pregnant female mouse strain of embryo transplantation is best to use CD1. in the end we embryos only CD1 female rat reproductive success, that microinjection platform preliminary construction is completed.
In order to carry out the work in the knockout mice were injected on the construction of our platform by using CRISPR-CAS9 technology, we chose the epididymis specific gene Teddml and serpina1f, because of the time, we completed the target gene design work, Cas9RNA construction and subsequent gRNA preparation work is underway. I believe in the future of CRISPR/Cas technology in the field of genetically modified to obtain the comprehensive development, and effectively promote the process of gene function.

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R711.74

【共引文獻】

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本文編號：1621994