本文選題：S100A6　切入點：宮頸癌　出處：《重慶醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景和目的宮頸癌是全球第二大常見的婦科癌癥,是女性癌癥相關死亡的主要原因之一。細胞學篩查的普及和疫苗的應用使宮頸癌在早期診斷和預防方面取得了長足的進步,但其轉(zhuǎn)移和復發(fā)仍然是其主要的死亡原因。因此,進一步闡釋其發(fā)生發(fā)展機制和探尋治療新靶標對宮頸癌的預防和治療具有積極意義。S100A6是S100家族成員之一,參與多種生物學作用。近年來,S100A6在腫瘤中的作用成為研究熱點。已有研究表明,它在人結直腸癌、胃癌、肝癌和骨肉瘤等多種腫瘤的進程中具有重要作用。在宮頸鱗癌組織中,該蛋白的表達明顯升高,并與病變惡性程度和淋巴結轉(zhuǎn)移成正相關。但是,S100A6對宮頸癌細胞增殖、遷移的明確作用尚無報道。因此,本課題以宮頸癌細胞為研究對象,探討S100A6對其增殖、凋亡和遷移的影響及其機制,為闡明宮頸癌進展機制積累實驗依據(jù),為該病的診斷及治療提供新的靶標及理論依據(jù)。方法1.宮頸癌細胞系中S100A6的內(nèi)源性表達用定量多聚酶鏈反應(q PCR)測定宮頸癌細胞系中S100A6的內(nèi)源性表達。2.制備S100A6表達的干預工具及其效果驗證(1)重組腺病毒的擴增和干預效果驗證通過將分別攜帶人S100A6基因及其干擾RNA的編碼序列的重組腺病毒Ad S100A6和Adsi S100A6及各自對照Ad GFP和Ad RFP感染人胚腎細胞HEK293進行擴增;再將這些重組腺病毒分別感染宮頸癌細胞后提取總蛋白,Western Blot驗證這些病毒的感染對S100A6基因表達的干預效果。(2)重組蛋白GST-S100A6的制備與鑒定將重組質(zhì)粒p GST-moluc-S100A6轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)中,于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),用IPTG誘導該融合蛋白表達;培養(yǎng)6-8 h后,收集菌液;超聲破菌;再用GS 4B球珠分離純化其中的該重組蛋白;采用SDS-PAGE、考馬斯亮藍染色、Western Blot對制備的GST-S100A6進行鑒定。3.S100A6對宮頸癌細胞增殖、凋亡和遷移的影響通過MTT法和Hoechst染色法分別檢測S100A6對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響;采用劃痕愈合試驗和Transwell試驗檢測S100A6對其遷移的作用。4.S100A6促宮頸癌細胞增殖、遷移的機制研究(1)Western Blot檢測S100A6處理后PI3K/Akt信號通路相關分子蛋白水平的改變,PCR檢測β-catenin下游靶基因m RNA水平的改變。(2)Western Blot檢測S100A6和PI3K抑制劑LY294002共同處理后PI3K/Akt信號通路的變化。MTT法和Transwell Assay檢測S100A6和LY294002共同處理后細胞增殖、遷移的變化。(3)PCR和Western Blot檢測S100A6對宮頸癌細胞EMT的影響。結果1.S100A6在He La細胞中低水平表達,而在Si Ha和Ca Ski細胞中的表達水平則相對更高,分別是He La細胞S100A6水平的6.92倍和7.54倍。2.經(jīng)Western Blot檢測發(fā)現(xiàn),Ad S100A6可以明顯增加被感染的宮頸癌細胞內(nèi)S100A6的水平,Adsi S100A6可以明顯減少S100A6的水平。提示:擴增的這兩種重組腺病毒感染能夠有效干預該基因的表達。經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色發(fā)現(xiàn),該重組蛋白的相對分子質(zhì)量約為36 k D,符合我們對GST-S100A6分子量的預期;同時,該重組蛋白可以被S100A6單克隆抗體特異性識別(Western Blot)。提示:制備的重組蛋白是GST-S100A6。3.S100A6對宮頸癌細胞增殖、凋亡和遷移的影響(1)Ad S100A6感染后的He La和Ca Ski細胞的增殖能力明顯增強,其72 h時的OD492值分別是各自對照組的1.2倍(P0.01)和1.3倍(P0.005),而Adsi S100A6感染的Si Ha和Ca Ski細胞的增殖能力則明顯降低,其72 h時的OD492值僅為各自對照組的81.9%和81.3%(P0.05)。提示S100A6具有促宮頸癌細胞增殖的作用。(2)與各自對照相比,經(jīng)Ad S100A6上調(diào)S100A6表達的He La和Ca Ski細胞的凋亡數(shù)目無明顯變化;經(jīng)Adsi S100A6下調(diào)S100A6表達后的Si Ha和Ca Ski細胞的凋亡數(shù)也無明顯變化。提示S100A6對宮頸癌細胞的凋亡無明顯影響。(3)Ad S100A6處理72 h的He La細胞的劃痕愈合率是Ad GFP處理組的2.1倍(P0.05);Ad S100A6處理72 h的Ca Ski細胞的劃痕愈合率是Ad GFP處理組的3.6倍(P0.01)。與之一致的是,Adsi S100A6處理后細胞的劃痕愈合率則明顯降低,Si Ha細胞和Ca Ski細胞72 h的劃痕愈合率分別是各自對照組(Ad RFP處理)的59%和56%(P0.05)。提示,S100A6可以促進宮頸癌細胞遷移。Ad S100A6感染72 h的He La細胞組的穿膜細胞數(shù)是Ad GFP組的5倍(P0.005);Ad S100A6感染72 h的Ca Ski細胞組的穿膜細胞數(shù)是Ad GFP組的2倍(P0.01);Adsi S100A6處理72 h的Si Ha細胞和Ca Ski細胞組的穿膜細胞數(shù)則分別只有各自Ad RFP組的34%(P0.005)和35%(P0.01)。該結果與劃痕試驗結果一致地提示S100A6可促進宮頸癌細胞遷移。4.S100A6促宮頸癌細胞增殖、遷移的機制探討(1)S100A6可激活宮頸癌細胞中的PI3K/Akt信號通路。與對照組相比,Ad S100A6組p-Akt、p-GSK3β和β-catenin的蛋白水平明顯上升,c-myc、MMP7和cyclin D1的m RNA水平也明顯上升。(2)S100A6促進宮頸癌細胞增殖和遷移的作用與PI3K/Akt信號通路的激活有關。(1)LY294002可以明顯降低He La細胞的p-Akt水平,其最適濃度為10μM;(2)LY294002處理對S100A6上調(diào)p-Akt,p-GSK3β和β-catenin的活性具有抑制作用;(3)LY294002處理可以明顯抑制S100A6增強的He La細胞的增殖能力,其48 h時的OD492值是對照組的60%(P0.05),72 h時的OD492值是對照組的49.9%(P0.005);(4)LY294002處理可以明顯抑制S100A6增強的He La細胞的遷移能力,其72 h時的穿膜細胞數(shù)為對照組的57.14%(P0.005)。(3)S100A6可促進宮頸癌細胞的EMT:與對照組相比,Ad S100A6可以明顯上調(diào)He La細胞中N-cadherin的蛋白水平和vimentin、Snail、Twist的m RNA水平,而Adsi S100A6可以明顯上調(diào)Si Ha細胞中E-cadherin的蛋白水平及下調(diào)N-cadherin的蛋白水平和vimentin、Snail、Twist的m RNA水平。結論S100A6促進宮頸癌細胞增殖、遷移和EMT;其促進宮頸癌細胞增殖和遷移的效應與PI3K/Akt信號通路的激活有關。即S100A6參與促進宮頸癌的惡性進展,是其診斷及治療的潛在靶點。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

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本文編號：1621814