本文選題：S100A6　切入點(diǎn)：宮頸癌　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的宮頸癌是全球第二大常見(jiàn)的婦科癌癥,是女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。細(xì)胞學(xué)篩查的普及和疫苗的應(yīng)用使宮頸癌在早期診斷和預(yù)防方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,但其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是其主要的死亡原因。因此,進(jìn)一步闡釋其發(fā)生發(fā)展機(jī)制和探尋治療新靶標(biāo)對(duì)宮頸癌的預(yù)防和治療具有積極意義。S100A6是S100家族成員之一,參與多種生物學(xué)作用。近年來(lái),S100A6在腫瘤中的作用成為研究熱點(diǎn)。已有研究表明,它在人結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌和骨肉瘤等多種腫瘤的進(jìn)程中具有重要作用。在宮頸鱗癌組織中,該蛋白的表達(dá)明顯升高,并與病變惡性程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。但是,S100A6對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移的明確作用尚無(wú)報(bào)道。因此,本課題以宮頸癌細(xì)胞為研究對(duì)象,探討S100A6對(duì)其增殖、凋亡和遷移的影響及其機(jī)制,為闡明宮頸癌進(jìn)展機(jī)制積累實(shí)驗(yàn)依據(jù),為該病的診斷及治療提供新的靶標(biāo)及理論依據(jù)。方法1.宮頸癌細(xì)胞系中S100A6的內(nèi)源性表達(dá)用定量多聚酶鏈反應(yīng)(q PCR)測(cè)定宮頸癌細(xì)胞系中S100A6的內(nèi)源性表達(dá)。2.制備S100A6表達(dá)的干預(yù)工具及其效果驗(yàn)證(1)重組腺病毒的擴(kuò)增和干預(yù)效果驗(yàn)證通過(guò)將分別攜帶人S100A6基因及其干擾RNA的編碼序列的重組腺病毒Ad S100A6和Adsi S100A6及各自對(duì)照Ad GFP和Ad RFP感染人胚腎細(xì)胞HEK293進(jìn)行擴(kuò)增;再將這些重組腺病毒分別感染宮頸癌細(xì)胞后提取總蛋白,Western Blot驗(yàn)證這些病毒的感染對(duì)S100A6基因表達(dá)的干預(yù)效果。(2)重組蛋白GST-S100A6的制備與鑒定將重組質(zhì)粒p GST-moluc-S100A6轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)中,于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng),用IPTG誘導(dǎo)該融合蛋白表達(dá);培養(yǎng)6-8 h后,收集菌液;超聲破菌;再用GS 4B球珠分離純化其中的該重組蛋白;采用SDS-PAGE、考馬斯亮藍(lán)染色、Western Blot對(duì)制備的GST-S100A6進(jìn)行鑒定。3.S100A6對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響通過(guò)MTT法和Hoechst染色法分別檢測(cè)S100A6對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響;采用劃痕愈合試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)檢測(cè)S100A6對(duì)其遷移的作用。4.S100A6促宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移的機(jī)制研究(1)Western Blot檢測(cè)S100A6處理后PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白水平的改變,PCR檢測(cè)β-catenin下游靶基因m RNA水平的改變。(2)Western Blot檢測(cè)S100A6和PI3K抑制劑LY294002共同處理后PI3K/Akt信號(hào)通路的變化。MTT法和Transwell Assay檢測(cè)S100A6和LY294002共同處理后細(xì)胞增殖、遷移的變化。(3)PCR和Western Blot檢測(cè)S100A6對(duì)宮頸癌細(xì)胞EMT的影響。結(jié)果1.S100A6在He La細(xì)胞中低水平表達(dá),而在Si Ha和Ca Ski細(xì)胞中的表達(dá)水平則相對(duì)更高,分別是He La細(xì)胞S100A6水平的6.92倍和7.54倍。2.經(jīng)Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Ad S100A6可以明顯增加被感染的宮頸癌細(xì)胞內(nèi)S100A6的水平,Adsi S100A6可以明顯減少S100A6的水平。提示:擴(kuò)增的這兩種重組腺病毒感染能夠有效干預(yù)該基因的表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn),該重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為36 k D,符合我們對(duì)GST-S100A6分子量的預(yù)期;同時(shí),該重組蛋白可以被S100A6單克隆抗體特異性識(shí)別(Western Blot)。提示:制備的重組蛋白是GST-S100A6。3.S100A6對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響(1)Ad S100A6感染后的He La和Ca Ski細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng),其72 h時(shí)的OD492值分別是各自對(duì)照組的1.2倍(P0.01)和1.3倍(P0.005),而Adsi S100A6感染的Si Ha和Ca Ski細(xì)胞的增殖能力則明顯降低,其72 h時(shí)的OD492值僅為各自對(duì)照組的81.9%和81.3%(P0.05)。提示S100A6具有促宮頸癌細(xì)胞增殖的作用。(2)與各自對(duì)照相比,經(jīng)Ad S100A6上調(diào)S100A6表達(dá)的He La和Ca Ski細(xì)胞的凋亡數(shù)目無(wú)明顯變化;經(jīng)Adsi S100A6下調(diào)S100A6表達(dá)后的Si Ha和Ca Ski細(xì)胞的凋亡數(shù)也無(wú)明顯變化。提示S100A6對(duì)宮頸癌細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯影響。(3)Ad S100A6處理72 h的He La細(xì)胞的劃痕愈合率是Ad GFP處理組的2.1倍(P0.05);Ad S100A6處理72 h的Ca Ski細(xì)胞的劃痕愈合率是Ad GFP處理組的3.6倍(P0.01)。與之一致的是,Adsi S100A6處理后細(xì)胞的劃痕愈合率則明顯降低,Si Ha細(xì)胞和Ca Ski細(xì)胞72 h的劃痕愈合率分別是各自對(duì)照組(Ad RFP處理)的59%和56%(P0.05)。提示,S100A6可以促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移。Ad S100A6感染72 h的He La細(xì)胞組的穿膜細(xì)胞數(shù)是Ad GFP組的5倍(P0.005);Ad S100A6感染72 h的Ca Ski細(xì)胞組的穿膜細(xì)胞數(shù)是Ad GFP組的2倍(P0.01);Adsi S100A6處理72 h的Si Ha細(xì)胞和Ca Ski細(xì)胞組的穿膜細(xì)胞數(shù)則分別只有各自Ad RFP組的34%(P0.005)和35%(P0.01)。該結(jié)果與劃痕試驗(yàn)結(jié)果一致地提示S100A6可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移。4.S100A6促宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移的機(jī)制探討(1)S100A6可激活宮頸癌細(xì)胞中的PI3K/Akt信號(hào)通路。與對(duì)照組相比,Ad S100A6組p-Akt、p-GSK3β和β-catenin的蛋白水平明顯上升,c-myc、MMP7和cyclin D1的m RNA水平也明顯上升。(2)S100A6促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的作用與PI3K/Akt信號(hào)通路的激活有關(guān)。(1)LY294002可以明顯降低He La細(xì)胞的p-Akt水平,其最適濃度為10μM;(2)LY294002處理對(duì)S100A6上調(diào)p-Akt,p-GSK3β和β-catenin的活性具有抑制作用;(3)LY294002處理可以明顯抑制S100A6增強(qiáng)的He La細(xì)胞的增殖能力,其48 h時(shí)的OD492值是對(duì)照組的60%(P0.05),72 h時(shí)的OD492值是對(duì)照組的49.9%(P0.005);(4)LY294002處理可以明顯抑制S100A6增強(qiáng)的He La細(xì)胞的遷移能力,其72 h時(shí)的穿膜細(xì)胞數(shù)為對(duì)照組的57.14%(P0.005)。(3)S100A6可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的EMT:與對(duì)照組相比,Ad S100A6可以明顯上調(diào)He La細(xì)胞中N-cadherin的蛋白水平和vimentin、Snail、Twist的m RNA水平,而Adsi S100A6可以明顯上調(diào)Si Ha細(xì)胞中E-cadherin的蛋白水平及下調(diào)N-cadherin的蛋白水平和vimentin、Snail、Twist的m RNA水平。結(jié)論S100A6促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和EMT;其促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移的效應(yīng)與PI3K/Akt信號(hào)通路的激活有關(guān)。即S100A6參與促進(jìn)宮頸癌的惡性進(jìn)展,是其診斷及治療的潛在靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1621814