本文關(guān)鍵詞： 妊娠丟失 過(guò)繼轉(zhuǎn)輸 淋巴細(xì)胞 Exosomes 母胎免疫耐受 穿孔素 CD28　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：習(xí)慣性流產(chǎn)是指連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的流產(chǎn)。其中60%左右為不明原因習(xí)慣性流產(chǎn)(URSA)，主要與免疫因素有關(guān)。生殖免疫研究認(rèn)為，URSA是由于孕期母體對(duì)胚胎父系抗原耐受性不足或缺乏所致。因此，調(diào)節(jié)母體針對(duì)胚胎父系抗原的免疫應(yīng)答，有效誘導(dǎo)母胎免疫耐受,是治療URSA的關(guān)鍵。 目前，國(guó)內(nèi)外多采用患者丈夫或無(wú)關(guān)個(gè)體的T淋巴細(xì)胞對(duì)URSA母體進(jìn)行免疫治療，取得了明顯療效，但仍存在制備不規(guī)范、個(gè)體差異大、療效不穩(wěn)定等缺陷，限制了臨床推廣應(yīng)用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞在生長(zhǎng)增殖過(guò)程中分泌釋放的一種稱為Exosomes（Exo）的膜性非細(xì)胞微囊結(jié)構(gòu)，可攜帶T細(xì)胞的核心功能分子，其獨(dú)具優(yōu)勢(shì)的強(qiáng)穩(wěn)定性、可規(guī)范性及高效安全性極具研究?jī)r(jià)值和廣闊應(yīng)用前景。本研究采用URSA實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，分析成年男性T淋巴細(xì)胞來(lái)源Exo調(diào)節(jié)母胎界面穿孔素以及CD28分子的表達(dá)，，探討其誘導(dǎo)母胎免疫耐受的相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制。 方法： 1.成年男性T淋巴細(xì)胞來(lái)源Exo的制備及初步鑒定：取成年健康男性靜脈血提取淋巴細(xì)胞，經(jīng)植物凝集素(PHA)體外誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化增殖后采用蔗糖密度梯度離心聯(lián)合超濾技術(shù)獲得Exo；掃描、透射電鏡觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)，紫外分光光度法測(cè)定其蛋白含量。 2.雄性小鼠無(wú)關(guān)個(gè)體脾細(xì)胞及其Exo的制備：斷頸處死BALB/c雄鼠，無(wú)菌條件下解剖獲取脾臟，經(jīng)研磨、過(guò)濾，去除紅細(xì)胞后制備脾細(xì)胞懸液，經(jīng)刀豆蛋白A(ConA)體外誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化增殖后采用蔗糖密度梯度離心聯(lián)合超濾技術(shù)獲得Exo。 3.URSA動(dòng)物模型建立及實(shí)驗(yàn)分組：將雌雄小鼠按2:1合籠交配；CBA/J(♀)×BALB/c(♂)為正常妊娠對(duì)照組(Control)，CBA/J(♀)×DBA/2(♂)為URSA動(dòng)物模型。再將URSA孕鼠隨機(jī)分為4組：①妊娠丟失組(URSA組，于孕第4天著床期時(shí)尾靜脈注射生理鹽水)②細(xì)胞治療組(CellularTherapy組，于孕第4天時(shí)尾靜脈注射無(wú)關(guān)雄性個(gè)體脾細(xì)胞)③鼠源Exo治療組（Exo Therapy-Ⅰ組，于孕第4天尾靜脈注射小鼠雄性個(gè)體脾T淋巴細(xì)胞來(lái)源Exo）④人源Exo治療組(Exo Therapy-Ⅱ組，于孕第4天時(shí)尾靜脈注射成年男性T淋巴細(xì)胞來(lái)源Exo)。 4.胚胎發(fā)育情況的觀察：于妊娠第14天時(shí)分別將各組CBA/J孕鼠處死，測(cè)量并計(jì)算胎盤體積，計(jì)數(shù)各組吸收胚胎個(gè)數(shù)和存活胚胎個(gè)數(shù)，計(jì)算胚胎吸收率及妊娠丟失率。 5.孕鼠母胎界面穿孔素及CD28分子的表達(dá)分析：各組CBA/J孕鼠于妊娠第14天分別處死，解剖孕鼠取出胎盤組織，制備石蠟包埋切片。經(jīng)免疫組化染色后進(jìn)行圖像分析，穿孔素及CD28分子表達(dá)強(qiáng)度以灰度值(GS)表示，GS值大小與陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；以矩形走形計(jì)數(shù)200個(gè)淋巴細(xì)胞，分別計(jì)算各組陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)百分率。 6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：各組數(shù)據(jù)均通過(guò)SPSS13.0版本軟件行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)，采用卡方檢驗(yàn)比較各組孕鼠胚胎發(fā)育情況；采用F檢驗(yàn)對(duì)孕鼠胎盤穿孔素及CD28分子的表達(dá)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，S-N-K法對(duì)多個(gè)樣本均數(shù)間進(jìn)行兩兩比較。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果： 1Exo的初步鑒定 掃描及透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞來(lái)源Exo呈橢圓形或圓形杯口狀，直徑約30nm～100nm，雙層脂質(zhì)膜完整，內(nèi)為低電子密度物質(zhì)。紫外分光光度法檢測(cè)鼠源Exo、人源Exo蛋白含量分別為0.413±0.067,0.407±0.082（P0.05）。 2不同過(guò)繼轉(zhuǎn)輸治療對(duì)妊娠丟失孕鼠胚胎發(fā)育的影響 Control組孕鼠胚胎吸收率為5.65%，URSA組為21.15%，細(xì)胞治療組、鼠源Exo治療組、人源Exo治療組分別為8.01%、3.41%、2.05%。與URSA組相比，細(xì)胞治療組、非細(xì)胞治療組的胚胎吸收率均顯著下降(均P0.01)，其中，細(xì)胞治療組及鼠源Exo治療組可降至Control組水平（均P0.05），而人源Exo治療組降低至低于Control組水平(P0.05)。 Control組孕鼠妊娠丟失率為26%， URSA組為66%，細(xì)胞治療組、鼠源Exo治療組、人源Exo治療組分別為24%、18%、14%。與URSA組相比，細(xì)胞治療組、非細(xì)胞治療組的妊娠丟失率均顯著下降(均P0.01)；其中，細(xì)胞治療組及鼠源Exo治療組可降至Control組水平（均P0.05），而人源Exo治療組降低至低于Control組水平(P0.05)。 3不同過(guò)繼轉(zhuǎn)輸治療對(duì)妊娠丟失孕鼠母胎界面穿孔素表達(dá)的影響 Control組孕鼠胎盤組織中穿孔素陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率為18.7%±2.0%，URSA組顯著上升為29.9%±2.6%(P0.0005)；細(xì)胞治療以及鼠源、人源Exo治療后陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率分別回降至17.7%±1.2%、13.0%±1.9%、11.1%±2.1%(均P0.0005)；其中，兩種非細(xì)胞治療組較細(xì)胞治療組及Control組表達(dá)水平均顯著降低(均P0.05)，鼠源、人源Exo治療組之間未見(jiàn)顯著差異(P0.05)。 Control組孕鼠胎盤組織中穿孔素表達(dá)強(qiáng)度的GS值為130.9±6.1，URSA組顯著上升為93.9±9.9(P0.0005)；細(xì)胞治療以及鼠源、人源Exo治療后表達(dá)強(qiáng)度分別回降至134.0±5.9、154.2±8.2、154.7±9.3(均P0.0005)；其中,非細(xì)胞治療組較細(xì)胞治療組及Control組表達(dá)水平均顯著降低(均P0.05)，鼠源、人源Exo治療組之間未見(jiàn)顯著差異(P0.05)。 4不同過(guò)繼轉(zhuǎn)輸治療對(duì)妊娠丟失孕鼠母胎界面CD28分子表達(dá)的影響 Control組孕鼠胎盤組織中CD28分子陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率52.7%±5.3%，URSA組顯著上升為65.8%±8.2%(P0.05)；細(xì)胞治療以及鼠源、人源Exo治療后陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率分別回降至50.2%±4.7%、34.7%±5.6%、25.8%±4.4%(分別P0.05、P0.001、P0.001)；其中非細(xì)胞治療組較細(xì)胞治療組及Control組表達(dá)水平均顯著降低(均P0.05)，人源Exo治療組比鼠源Exo治療效果更顯著（P0.05)。 Control組孕鼠胎盤組織中CD28分子表達(dá)強(qiáng)度為117.9±2.7，URSA組顯著上升為96.7±6.8(P0.001)；細(xì)胞治療以及鼠源、人源Exo治療后表達(dá)強(qiáng)度分別回降至117.3±2.2、130.9±4.7、143.9±7.1(分別P0.05、P0.001、P0.001)；其中非細(xì)胞治療組較細(xì)胞治療組及Control組表達(dá)水平均顯著降低(均P0.05)，人源Exo治療組比鼠源Exo治療效果更顯著（P0.0005)。 結(jié)論： 1無(wú)關(guān)雄性個(gè)體外周淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞來(lái)源Exosomes均可有效誘導(dǎo)母胎免疫耐受形成，有利于妊娠順利進(jìn)行。且Exosomes可發(fā)揮比外周淋巴細(xì)胞更強(qiáng)大的效應(yīng)。 2無(wú)關(guān)雄性個(gè)體外周淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞來(lái)源Exosomes均可通過(guò)共同或相似的作用途徑引發(fā)母胎界面穿孔素及CD28分子表達(dá)變化，降低T、NK細(xì)胞對(duì)胚胎抗原及胎盤組織細(xì)胞的毒性作用，從而有效誘導(dǎo)母胎免疫耐受。 3人源Exosomes可比鼠源Exosomes發(fā)揮更強(qiáng)大的誘導(dǎo)妊娠丟失孕鼠母胎免疫耐受的效應(yīng)。
[Abstract]:Objective: habitual abortion refers to the continuous occurrence of abortion 3 times or more than 3 times. About 60% of them for unexplained habitual abortion (URSA), mainly related to immunological factors. The immune response that is due to URSA caused by maternal paternal on embryo antigen tolerance insufficient. Therefore, regulation of the immune response according to the maternal embryo paternal antigen, effectively induce immune tolerance, is the key to the treatment of URSA.
At present, many domestic and foreign patients with husband or unrelated individual T lymphocyte immunotherapy on URSA matrix, has made the obvious effect, but there are still some preparation is not standardized, individual differences, the effect of unstable defects such as limited clinical application. Recent studies showed that T cells secrete in the process of proliferation a method called Exosomes (Exo) of the non cell membrane microcapsule structure, core functional molecules can carry T cells, the unique advantages of strong stability, can be very efficient and normative research of safety value and broad application prospects. This research adopts the URSA experimental animal model, analysis of adult male T lymphocyte derived Exo regulation maternal fetal interface of perforin and CD28 expression, to investigate the induction of immunotolerance related immunological mechanisms.
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本文編號(hào)：1520557