本文關(guān)鍵詞： 卵巢癌 CS SDHB 增殖 侵襲 遷移 耐藥 mt DNA　出處：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：線粒體是存在于真核細(xì)胞的雙層膜細(xì)胞器,主要功能是進(jìn)行三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化反應(yīng)。幾乎所有的喜氧生物都是以三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化作為產(chǎn)生ATP的主要方式,為細(xì)胞的活動(dòng)提供能量,因此線粒體被稱為“細(xì)胞動(dòng)力工廠”。線粒體基質(zhì)中除包含三羧酸循環(huán)酶系、線粒體基因表達(dá)酶系,還包括線粒體DNA、RNA和核糖體。線粒體是高等動(dòng)物細(xì)胞核外唯一含有DNA的細(xì)胞器,其中包含的人線粒體DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)是可獨(dú)立于核DNA之外進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的雙鏈閉合環(huán)狀分子。線粒體DNA可編碼13個(gè)與線粒體氧化磷酸化有關(guān)的蛋白。當(dāng)線粒體中三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化通路異常時(shí),例如三羧酸循環(huán)酶表達(dá)異常時(shí),線粒體的能量代謝也會(huì)發(fā)生異常,進(jìn)而影響細(xì)胞正常功能的實(shí)現(xiàn)。檸檬酸合成酶(Citrate synthase,CS)和琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase,SDH)是參與三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化的兩個(gè)酶。其中CS是參與三羧酸循環(huán)的限速酶,催化形成產(chǎn)物檸檬酸用于后續(xù)三羧酸循環(huán),或者轉(zhuǎn)運(yùn)至胞質(zhì)用于蛋白質(zhì)乙�；椭舅岽x;SDH是三羧酸循環(huán)中唯一的多亞基線粒體膜結(jié)合酶,包括A、B、C、D四個(gè)亞基,其中SDHB亞基(Succinate dehydrogenase subunit B)編碼鐵硫蛋白,參與構(gòu)成酶活性區(qū)域,此外SDH還參與線粒體氧化磷酸化呼吸鏈電子傳遞。CS和SDHB均由核基因編碼,參與線粒體能量代謝。目前,CS在惡性腫瘤中的表達(dá)和具體功能有不同的觀點(diǎn),研究報(bào)道胰腺癌和腎嗜酸細(xì)胞瘤中CS表達(dá)增加,而在多株宮頸癌細(xì)胞株中CS表達(dá)降低;SDH亞基突變能夠引起多種腫瘤,SDH可能是一種腫瘤抑制基因。以上研究提示三羧酸循環(huán)酶在腫瘤發(fā)生中有重要作用。正常狀態(tài)下,線粒體消耗的部分氧氣會(huì)轉(zhuǎn)化為超氧化物陰離子、過氧化氫和其他過氧化簇(reactive oxygen species,ROS)。與核DNA相比,由于線粒體DNA中無內(nèi)含子和保護(hù)性組蛋白,使得mt DNA容易受ROS攻擊,從而使DNA突變或者拷貝數(shù)發(fā)生變化。Mt DNA的這種改變會(huì)影響線粒體基因的表達(dá)和一系列線粒體的功能。因此mt DNA的異常改變進(jìn)而會(huì)影響線粒體氧化磷酸化反應(yīng),甚至導(dǎo)致惡性生長狀態(tài)。相反的,當(dāng)機(jī)體三羧酸循環(huán)-氧化磷酸化異常時(shí),機(jī)體會(huì)啟動(dòng)代償機(jī)制和應(yīng)急方式維持能量需求,線粒體DNA拷貝數(shù)的增加可能是一種代償機(jī)制來應(yīng)對線粒體呼吸功能異常。文獻(xiàn)報(bào)道非霍奇金淋巴瘤(NHL)細(xì)胞中線粒體DNA的增加與腫瘤微小殘留病/持續(xù)疾病狀態(tài)(MRD/PD)相關(guān),NHL化療后存活的殘余細(xì)胞中還檢測到ATP相關(guān)酶CS的上調(diào)和SDH的下調(diào),提示CS和SDH與mt DNA的拷貝數(shù)有一定關(guān)系。卵巢癌是常見婦科惡性腫瘤,由于臨床發(fā)現(xiàn)多是晚期而使死亡率較高。目前卵巢癌治療的瓶頸仍是轉(zhuǎn)移和耐藥,尋找卵巢癌轉(zhuǎn)移和耐藥新機(jī)制以及探索治療新靶點(diǎn)仍是重中之重。目前,僅有文獻(xiàn)報(bào)道CS在鼠卵巢癌模型中活性增加,CS和SDHB在人卵巢臨床標(biāo)本的表達(dá)以及與mt DNA拷貝數(shù)的關(guān)系并未進(jìn)行研究。基于上述基礎(chǔ),本課題針對CS、SDHB和mt DNA拷貝數(shù)在卵巢癌的表達(dá)進(jìn)行研究,體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CS基因沉默抑制卵巢癌細(xì)胞(SKOV3,A2780)增殖、侵襲、遷移能力,增加化療敏感性,降低mt DNA拷貝數(shù);SDHB基因沉默促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞中上述惡性生物學(xué)行為,降低順鉑敏感性,提高mt DNA拷貝數(shù)。本課題分為三個(gè)部分:(1)CS對卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用研究。(2)SDHB對卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用研究。(3)CS和SDHB對卵巢癌細(xì)胞線粒體DNA相對拷貝數(shù)的作用研究。第一部分 檸檬酸合成酶對卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用研究研究目的:研究檸檬酸合成酶(CS)在卵巢腫瘤組織和卵巢細(xì)胞中的表達(dá)水平,探索其對卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用和機(jī)制。研究方法:1.卵巢正常上皮細(xì)胞組織原代培養(yǎng),實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫蛋白印跡法檢測人卵巢腫瘤組織和卵巢細(xì)胞中檸檬酸合成酶m RNA和蛋白水平;2.設(shè)計(jì)合成干擾序列基因沉默CS,檢測CS基因沉默對細(xì)胞能量水平的影響(ATP、AMPK/P38MAPK);3.檢測基因沉默CS對卵巢癌細(xì)胞株增殖、侵襲和遷移的影響(CCK8實(shí)驗(yàn)、Transwell小室);Western blot檢測增殖相關(guān)信號蛋白p-ERK、凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2,cleaved caspase 3)及細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白分子(p-FAK,MMP2,Vimentin)的變化;4.檢測CS基因沉默對卵巢癌細(xì)胞耐藥性的影響(轉(zhuǎn)染組和對照組IC50值的變化、細(xì)胞凋亡水平、細(xì)胞克隆形成能力);DNA損傷修復(fù)角度探討CS參與卵巢癌化療耐藥的機(jī)制:Western blot檢測基因沉默前后卵巢癌細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)能力的變化(ERCC1,γ-H2AX);5.基因芯片技術(shù)檢測CS基因沉默前后基因水平變化,real-time PCR驗(yàn)證與耐藥、凋亡和自噬相關(guān)基因(CASP7,IRF7,DDX58,ISG15,ATG12)的水平變化。研究結(jié)果:1.卵巢癌組織中檸檬酸合成酶表達(dá)水平較卵巢良性腫瘤組織高,卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和A2780中CS水平較卵巢正常上皮細(xì)胞(HOSE)高;2.CS基因沉默前后細(xì)胞中ATP變化不明顯(P0.05),而AMPK/P38 MAPK顯著受抑制(P0.05);3.CS基因沉默降低卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和A2780細(xì)胞增殖速度(P0.05),促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P0.05),同時(shí)顯著抑制細(xì)胞的侵襲和遷移能力(P0.05);4.基因沉默CS明顯降低了卵巢癌細(xì)胞對順鉑的24小時(shí)半數(shù)抑制濃度IC50值(P0.05),細(xì)胞凋亡水平增加,化療藥物順鉑處理后卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成能力降低(P0.05);同時(shí)發(fā)現(xiàn)基因沉默CS后,細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力降低(ERCC1降低),DNA損傷增加(γ-H2AX增加);5.CS基因沉默明顯增加CASP7,IRF7,DDX58,ISG15基因水平(P0.05),而ATG12水平降低,但不顯著(P0.05)。結(jié)論:CS在卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞中高表達(dá),基因沉默CS能夠顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖活性,顯著降低卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力,也可以增加卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。CS通過影響ERK信號通路和細(xì)胞凋亡影響卵巢癌細(xì)胞的增殖活性,通過影響MMP2,p-FAK和Vimentin蛋白分子影響卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。CS沉默通過降低癌細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力、增加DNA損傷提高卵巢癌細(xì)胞的化療敏感性。第二部分 琥珀酸脫氫酶B亞基對卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的作用研究研究目的:研究琥珀酸脫氫酶B亞基(SDHB)在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達(dá)水平。探索SDHB對卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和化療敏感性的影響,并進(jìn)一步研究其中的相關(guān)機(jī)制。研究方法:1.Real-time PCR和Western blot檢測SDHB在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達(dá)水平;2.Western blot檢測不同卵巢癌細(xì)胞株中SDHB蛋白水平;3.SKOV3和A2780細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶B亞基基因沉默,檢測基因沉默對細(xì)胞能量水平的影響(ATP、AMPK/P38MAPK);4.檢測基因沉默SDHB對卵巢癌細(xì)胞株增殖、侵襲和遷移的影響(CCK8實(shí)驗(yàn),Transwell小室);Western blot檢測增殖相關(guān)信號蛋白p-ERK、凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2,cleaved caspase 3)及細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白分子(p-FAK,MMP2)的變化;5.觀察基因沉默SDHB對卵巢癌細(xì)胞耐藥性的影響(轉(zhuǎn)染組和對照組IC50值的變化、細(xì)胞凋亡水平、細(xì)胞克隆形成能力);DNA損傷修復(fù)角度探討SDHB參與卵巢癌化療耐藥的機(jī)制:通過Western blot檢測基因沉默前后卵巢癌細(xì)胞DNA損傷和修復(fù)能力的變化(ERCC1,γ-H2AX);6.構(gòu)建SDHB過表達(dá)質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)染SKOV3細(xì)胞進(jìn)行功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)(增殖、侵襲、遷移和化療敏感性相關(guān)實(shí)驗(yàn));7.從缺氧角度研究SDHB對卵巢癌影響的機(jī)制:檢測SDHB基因沉默和過表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α水平的影響;氯化鈷誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá),檢測SDHB與HIF-1α表達(dá)水平的關(guān)系。研究結(jié)果:1.SDHB在卵巢癌組織中表達(dá)低于正常卵巢組織(P0.05),而且m RNA水平在卵巢癌轉(zhuǎn)移灶低于原發(fā)灶(P0.05);2.不同卵巢癌細(xì)胞株中SDHB表達(dá)水平不同;3.SKOV3和A2780細(xì)胞中SDHB基因沉默降低細(xì)胞中ATP水平,AMPK/P38 MAPK上調(diào);4.SDHB基因沉默增加細(xì)胞增殖速度,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移能力;5.隨順鉑濃度增加,卵巢癌細(xì)胞中SDHB水平逐漸升高;基因沉默SDHB明顯增加卵巢癌細(xì)胞對順鉑的IC50值(P0.05)、減低細(xì)胞凋亡水平,增強(qiáng)細(xì)胞的克隆形成能力(P0.05);基因沉默SDHB后,細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力增加,DNA損傷降低;6.過表達(dá)SDHB后,SKOV3細(xì)胞惡性生物學(xué)行為(增殖、侵襲、遷移、化療敏感性)部分逆轉(zhuǎn);7.SDHB基因沉默增加HIF-1α表達(dá),過表達(dá)SDHB降低HIF-1α表達(dá),隨HIF-1α表達(dá)增加SDHB水平降低。.結(jié)論:SDHB在卵巢癌組織低表達(dá),尤其轉(zhuǎn)移灶中更低�；虺聊琒DHB能夠增加卵巢癌細(xì)胞的增殖活性,促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力,也可以降低卵巢癌細(xì)胞對順鉑的敏感性,而SDHB過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)上述惡性生物學(xué)行為。SDHB是通過影響HIF-1α表達(dá)而影響卵巢癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,通過影響DNA損傷水平影響化療敏感性。第三部分 檸檬酸合成酶和琥珀酸脫氫酶B亞基對卵巢癌細(xì)胞線粒體DNA相對拷貝數(shù)的作用研究研究目的:研究線粒體DNA相對拷貝數(shù)(mt ND2/HBB)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(TFAM)在卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤中的水平,探索CS和SDHB對線粒體DNA相對拷貝數(shù)的影響和相關(guān)機(jī)制。研究方法:1.Real-time PCR檢測卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織中線粒體DNA相對拷貝數(shù)和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A水平;2.Real-time PCR檢測卵巢癌組織和卵巢良性腫瘤組織中CS和SDHB基因水平;3.SKOV3和A2780細(xì)胞株分別基因沉默CS和SDHB,real-time PCR檢測基因沉默前后mt ND2/HBB和TFAM的表達(dá)水平;4.從線粒體DNA生成角度分別探索CS和SDHB對線粒體DNA相對拷貝數(shù)的影響:Western blot檢測ERK/P38 MAPK水平,real-time PCR檢測基因沉默前后線粒體DNA合成相關(guān)因子PGC-1α水平。研究結(jié)果:1.卵巢癌組織中線粒體DNA相對拷貝數(shù)和TFAM顯著高于卵巢良性腫瘤組織(P0.05);2.卵巢癌組織中CS基因水平顯著高于卵巢良性腫瘤組織(P0.01),而SDHB基因水平卵巢癌組織顯著低于卵巢良性腫瘤組織(P0.05);3.CS基因沉默降低顯著卵巢癌細(xì)胞SKOV3和A2780中mt ND2/HBB水平(P0.05),TFAM水平也降低但是不顯著(P0.05);SDHB基因沉默顯著增加卵巢癌細(xì)胞中mt ND2/HBB水平(P0.05),而TFAM水平增加不顯著(P0.05);4.CS基因沉默后SKOV3和A2780兩株細(xì)胞中ERK和P38磷酸化水平顯著降低(P0.05),同時(shí)PGC-1α基因水平降低但不顯著(P0.05);SDHB基因沉默后兩株細(xì)胞中ERK和P38磷酸化水平顯著上調(diào)(P0.05),PGC-1α基因水平上調(diào)不顯著(P0.05)。結(jié)論:卵巢癌組織中線粒體DNA相對拷貝數(shù)和TFAM水平均高于卵巢良性腫瘤組織,CS和SDHB表達(dá)水平影響卵巢癌細(xì)胞株線粒體相對拷貝數(shù),可能是通過影響ERK/P38 MAPK通路實(shí)現(xiàn)的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31

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本文編號：1495177