本文關(guān)鍵詞：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對POF大鼠卵巢修復(fù)作用研究

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【摘要】：目的探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)在POF(Premature ovarian failure,POF)大鼠卵巢內(nèi)的歸巢及對卵巢功能調(diào)節(jié)作用,為BMSCs移植治療卵巢早衰提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法1、大鼠BMSCs的體外分離、培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記:通過差異貼壁法從SD大鼠骨髓中分離BMSCs,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面因子CD29、CD45、CD34及CD90的表達(dá)鑒定BMSCs。流式細(xì)胞儀檢測BMSCs細(xì)胞周期明確細(xì)胞的生長特性。用攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因的腺病毒(Ad-EGFP)轉(zhuǎn)染BMSCs,分別用轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為50、100、150、200、400的Ad-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs,在24小時、48小時及72小時用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)及細(xì)胞形態(tài)變化,尋找最佳MOI。2、體外BMSCs對順鉑損傷顆粒細(xì)胞的影響:分離培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞(granulosa cells,GCs),通過免疫細(xì)胞化學(xué)檢測促卵泡激素受體(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)在顆粒細(xì)胞中表達(dá)來鑒定GCs。GCs加入不同濃度的順鉑(分別為1mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、7.5 mg/L、10 mg/L),通過CCK-8檢測順鉑對GCs生長影響,選用最佳濃度。在最佳濃度的順鉑作用下將BMSCs和GCs以1:1比例共培養(yǎng),48小時后收集GCs,Annexin-V/PI法檢測GCs凋亡率,并用結(jié)晶紫染色,觀察GCs形態(tài)變化。應(yīng)用Transwell法檢測BMSCs向順鉑損傷的GCs遷移能力。3、BMSCs在順鉑所致POF大鼠卵巢內(nèi)歸巢及對卵巢功能修復(fù)作用:SD大鼠連續(xù)腹腔注射順鉑(2mg/kg)6天建立POF動物模型。大鼠分為3組,每組10只:正常組,POF模型組,BMSCs治療組。將用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)標(biāo)記的BMSCs經(jīng)尾靜脈移植到POF大鼠體內(nèi),在移植后第15天和30天分批處死大鼠,收集血液和卵巢等組織。通過化學(xué)發(fā)光法檢測血清中雌激素水平;HE染色后觀察大鼠卵巢結(jié)構(gòu)及卵泡發(fā)育情況;免疫組織化學(xué)法檢測BMSCs在大鼠卵巢內(nèi)分布及定位;采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測卵巢GCs凋亡。結(jié)果1、原代BMSCs在接種24小時后貼壁生長,呈圓形,72小時后部分貼壁細(xì)胞形態(tài)為長梭形。第3代BMSCs表達(dá)CD29、CD90,而不表達(dá)CD34、CD45。BMSCs多數(shù)處于靜止期及DNA合成前期,只有少數(shù)處于DNA合成期和有絲分裂期。當(dāng)MOI為200時,EGFP標(biāo)記率高,且對細(xì)胞形態(tài)及生長無明顯影響,EGFP在轉(zhuǎn)染24小時后開始表達(dá),72小時后高表達(dá)。2、原代GCs在接種48小時后貼壁生長,呈圓形,細(xì)胞稀疏,傳代后細(xì)胞呈集落樣生長。第1代GCs表達(dá)FSHR,而多邊形及梭形雜細(xì)胞表達(dá)陰性。當(dāng)順鉑濃度為5mg/L和7.5mg/L時,顆粒細(xì)胞生長明顯受抑制。BMSCs與GCs共培養(yǎng)后,GCs存活率升高,凋亡率降低。當(dāng)GCs受順鉑損傷后,BMSCs向損傷的GCs遷移數(shù)明顯多于向正常GCs遷移數(shù)。3、BMSCs移植后,BMSCs主要分布在大鼠卵巢門和卵巢髓質(zhì)中,在卵巢皮質(zhì)有少量的BMSCs,且部分BMSCs圍繞在卵泡周邊,而在卵泡和黃體中沒有BMSCs的分布。BMSCs移植30天后,在BMSCs治療組大鼠卵巢中,竇狀卵泡和雌二醇水平明顯高于POF模型組。在BMSCs治療組大鼠卵巢中可見各級卵泡發(fā)育,并且有發(fā)育良好的竇狀卵泡及黃體。結(jié)論1、分離培養(yǎng)的BMSCs形態(tài)均一,表型穩(wěn)定,純度高,可用于進(jìn)一步的生物學(xué)研究。用Ad-EGFP轉(zhuǎn)染BMSCs安全、高效,可用于BMSCs的標(biāo)記及示蹤。2、BMSCs對順鉑損傷的卵巢顆粒細(xì)胞有保護(hù)作用。3、BMSCs可遷移到POF大鼠卵巢并有效地改善卵泡發(fā)育。因此,BMSCs可能是治療POF有效的手段之一。
【學(xué)位授予單位】：遼寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R711.75

【共引文獻(xiàn)】

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：1161846