發(fā)布時間：2017-09-20 05:07

  本文關(guān)鍵詞：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠早期放射性肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：放射性肺纖維化（radiation-induced lung fibrosis，RILF）是胸部腫瘤患者接受放療后最常見的并發(fā)癥，肺纖維化不可逆轉(zhuǎn)，可導(dǎo)致呼吸衰竭，甚至死亡。RILF由射線引起的早期間質(zhì)性肺炎逐漸過渡發(fā)展為后期纖維化損傷的過程，目前臨床上仍缺乏治療RILF有效方法。Ad-MSC是干細(xì)胞家族的成員，具有多向分化潛能，可誘導(dǎo)分化為脂肪、成骨及肺上皮等多種組織細(xì)胞，并有免疫調(diào)控的作用，已用于多種組織器官的損傷修復(fù)。與其他來源干細(xì)胞相比，Ad-MSC來源廣泛，可滿足臨床反復(fù)及多次的需求，且易于自體移植，無倫理道德爭議。已有研究證實(shí)，骨髓MSC對多種急性肺損傷有良好的修復(fù)作用。目前尚未見有關(guān)Ad-MSC與RILF的研究報道，研究Ad-MSC修復(fù)RILF具有重要的臨床意義。因此，本研究通過尾靜脈移植Ad-MSC治療SD大鼠RILF模型，觀察療效并探討其作用機(jī)制，為指導(dǎo)臨床Ad-MSC治療RILF提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為3部分： 1.大鼠早期放射性肺纖維化模型的建立及評價 本部分研究主要探索肺損傷程度與輻射劑量之間的關(guān)系，篩選出最佳的造模劑量，為下一步研究Ad-MSC治療RILF提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。RILF與動物品系、照射劑量、照射部位及射線種類等因素有關(guān)，其中，射線劑量的選擇尤為關(guān)鍵。本部分以SD大鼠為研究對象，單次大劑量X射線照射大鼠右側(cè)胸腔，設(shè)置4個劑量梯度：7.5Gy、15Gy、22.5Gy和30Gy，并于照射后的第28d對入組大鼠的一般狀態(tài)、生存狀態(tài)及肺組織病理HE和Masson染色等進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：接受7.5Gy組大鼠在照射后28d存活率較高（93.33%），其肺組織病理損傷較輕微，RILI的疾病特征不明顯；然而，30Gy組大鼠在照射后10d內(nèi)全部死亡；15Gy和22.5Gy在照射后28d內(nèi)大鼠存活率分別為66.67%和26.67%，并出現(xiàn)典型的肺組織損傷變化，主要包括肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺間質(zhì)水腫，肺泡壁明顯增厚，肺間質(zhì)內(nèi)散在大量藍(lán)色膠原纖維，肺泡腔變小，支氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤，此病理變化符合RILF的疾病特征。雖然22.5Gy劑量能在較短時間內(nèi)成功建立大鼠RILF模型，但此劑量下大鼠存活率低，不適合本實(shí)驗(yàn)后續(xù)所需的大數(shù)量的模型要求。以上結(jié)果表明肺損傷程度與輻射劑量呈線性關(guān)系，考慮到模型數(shù)量與質(zhì)量的需求，我們采用15Gy劑量制作RILF大鼠模型，該劑量能在較短時間內(nèi)成功模擬典型的肺纖維化特征，保證模型的成功率和生存率，為后續(xù)研究Ad-MSC治療RILF提供了保證。 2.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性體外鑒定 在Ad-MSC的臨床應(yīng)用中，獲得足夠數(shù)量的高活性與高純度Ad-MSC至關(guān)重要。本研究采用密度梯度離心技術(shù)結(jié)合貼壁法分離培養(yǎng)大鼠Ad-MSC，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定，，為Ad-MSC作為理想種子細(xì)胞在臨床中的應(yīng)用提供依據(jù)。本部分以3日齡雌性SD大鼠為研究對象，無菌狀態(tài)下取雙側(cè)腹股溝處脂肪組織，分離培養(yǎng)Ad-MSC，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)；應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志；誘導(dǎo)分化培養(yǎng)體系鑒定Ad-MSC向成脂、成骨及成軟骨分化的能力。結(jié)果顯示：①A d-MSC均貼壁生長，呈成纖維細(xì)胞樣，具有MSC的典型形態(tài)；②細(xì)胞表面表達(dá)CD29和CD44典型干細(xì)胞表面抗原，不表達(dá)CD11和CD45等造血和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志；③Ad-MSC在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)體系中可向成骨、軟骨和脂肪細(xì)胞分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了此研究中所分離培養(yǎng)的Ad-MSC是均一純度較高的細(xì)胞群，并具有自我更新能力和多向分化潛能，符合國際上對MSC的界定標(biāo)準(zhǔn)，滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的要求。 3.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠早期放射性肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究 在前兩部分研究中，先通過評估射線誘導(dǎo)的肺損傷與照射劑量之間的關(guān)系，篩選出最佳模型劑量15Gy，采用密度梯度離心技術(shù)結(jié)合貼壁法成功分離培養(yǎng)出高純度高活性的Ad-MSC。在本部分研究中，我們采用15Gy X射線照射SD大鼠建立RILF模型，分離并傳代大鼠Ad-MSC至P3代后，經(jīng)尾靜脈移植到RILF大鼠模型，并在不同時間點(diǎn)評估RILF大鼠生存率與肺組織病理情況，從炎癥因子水平、纖維化因子水平、肺組織細(xì)胞凋亡水平及上皮細(xì)胞分化修復(fù)等方面探討了Ad-MSC對急性RILF治療效果及作用機(jī)制。結(jié)果顯示：①Ad-MSC治療組大鼠在受照后28d的生存率較單純照射組顯著提高（P0.05）；②Ad-MSC治療組肺組織病理明顯減輕，肺泡結(jié)構(gòu)基本正常保存，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁無明顯增厚，肺間質(zhì)內(nèi)僅散在少量藍(lán)色膠原纖維，與單純照射組相比有顯著性差異（P0.01）；③Ad-MSC顯著抑制外周血促炎因子TNF-α、IL-1和IL-6表達(dá)，并提高抗炎因子IL-10表達(dá)來減輕RILI大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)；④Ad-MSC下調(diào)肺組織促纖維化因子TGF-β1、α-SMA和Col1al的表達(dá)，上調(diào)HGF的表達(dá)來抑制纖維化反應(yīng)的發(fā)生；⑤Ad-MSC下調(diào)促凋亡蛋白Bax和caspase-3表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)來抵抗RILF肺組織細(xì)胞的凋亡，從而維持肺泡結(jié)構(gòu)完整。⑥Ad-MSC于移植后第7d在受照射肺組織中表達(dá)SP-C，Ad-MSC可直接分化成Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞，具有修復(fù)肺泡上皮的能力。 綜上所述，Ad-MSC明顯提高了RILF模型大鼠的生存率，顯著減輕大鼠肺組織損傷，作用機(jī)制主要與Ad-MSC的抗炎、抗纖維化、抗凋亡及直接分化成肺上皮細(xì)胞的能力密切相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 干細(xì)胞 放射性肺纖維化 細(xì)胞移植
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.55
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 緒論14-16
• 第2章 文獻(xiàn)綜述16-26
• 2.1 RILF16-18
• 2.1.1 RILF 概述16
• 2.1.2 RILF 發(fā)生機(jī)制16-17
• 2.1.3 RILF 治療現(xiàn)狀17-18
• 2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞18-21
• 2.2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞概述18
• 2.2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性18-20
• 2.2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用現(xiàn)狀20
• 2.2.4 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用優(yōu)勢20-21
• 2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)早期肺纖維化21-24
• 2.3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)早期肺纖維化機(jī)制21-23
• 2.3.2 間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)肺纖維化的研究現(xiàn)狀23-24
• 2.4 立題依據(jù)24-26
• 第3章 大鼠早期放射性肺纖維化模型的建立及評價26-36
• 3.1 引言26
• 3.2 材料與方法26-30
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-30
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-33
• 3.3.1 照射后大鼠生存狀態(tài)分析30-31
• 3.3.2 肺臟大體標(biāo)本結(jié)果31-32
• 3.3.3 病理組織學(xué)改變32-33
• 3.4 討論33-34
• 3.5 小結(jié)34-36
• 第4章 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性體外鑒定36-42
• 4.1 引言36
• 4.2 材料與方法36-38
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料36-37
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法37-38
• 4.3 結(jié)果38-40
• 4.3.1 Ad-MSC 體外培養(yǎng)的形態(tài)觀察38-39
• 4.3.2 Ad-MSC 誘導(dǎo)分化能力39
• 4.3.3 Ad-MSC 表型鑒定39-40
• 4.4 討論40-41
• 4.5 小結(jié)41-42
• 第5章 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠早期放射性肺纖維化實(shí)驗(yàn)研究2942-72
• 5.1 引言42
• 5.2 材料與方法42-55
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料42-46
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)方法46-55
• 5.3 結(jié)果55-67
• 5.3.1 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定55
• 5.3.2 大鼠生存狀態(tài)分析55-56
• 5.3.3 Ad-MSC 趨化能力鑒定56-58
• 5.3.4 肺組織病理學(xué)觀察58-60
• 5.3.5 外周血炎癥細(xì)胞因子含量變化60-61
• 5.3.6 外周血抗炎癥細(xì)胞因子 IL-10 含量變化61
• 5.3.7 纖維化因子含量變化61-64
• 5.3.8 肺組織凋亡分析64-66
• 5.3.9 HGF 含量檢測66
• 5.3.10 Ad-MSC 分化為Ⅱ型肺上皮細(xì)胞66-67
• 5.4 討論67-71
• 5.5 小結(jié)71-72
• 第6章 全文結(jié)論72-74
• 參考文獻(xiàn)74-86
• 作者簡介及攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文86-88
• 致謝88

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 蔡紅兵,羅榮城;放射性肺損傷的中醫(yī)藥防治方法探討[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2003年09期

2 房麗;榮紹元;王紅陽;劉衛(wèi)東;;地塞米松防治急性放射性肺損傷療效觀察[J];山東醫(yī)藥;2009年04期

本文編號：886068