本文關(guān)鍵詞：弗林酶靶向的新型腫瘤PET探針的制備及性能研究

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【摘要】：腫瘤的早期診斷是人類對(duì)抗腫瘤的一個(gè)重要因素。在腫瘤的診斷技術(shù)中,正電子斷層顯像(PET)因其具有早期、靈敏和準(zhǔn)確地診斷腫瘤的優(yōu)點(diǎn)而得到了日益廣泛的應(yīng)用。開(kāi)發(fā)新型PET探針對(duì)于擴(kuò)展PET的臨床應(yīng)用非常重要。為獲得較好的PET顯像效果,針對(duì)特定靶標(biāo)設(shè)計(jì)的PET探針能夠通過(guò)靶標(biāo)識(shí)別有效的到達(dá)靶向位點(diǎn),從而增強(qiáng)PET顯像的特異性。本論文設(shè)計(jì)的PET探針的靶標(biāo)是弗林蛋白酶(furin),furin是一種重要的內(nèi)切蛋白酶,在多種腫瘤中表達(dá)上升,增加腫瘤侵襲性和生長(zhǎng)速度,因此設(shè)計(jì)靶標(biāo)為furin的PET探針可以對(duì)腫瘤進(jìn)行早期診斷。本論文設(shè)計(jì)新型靶向furin的腫瘤PET探針~(18)F-FBCKR,該探針首次將furin靶標(biāo)識(shí)別、酶控納米自組裝技術(shù)與PET成像技術(shù)相結(jié)合,利用一個(gè)新型的縮合反應(yīng),設(shè)計(jì)了靶向furin的小分子PET探針。該P(yáng)ET探針~(18)F-FBCKR包含如下幾個(gè)功能組成部分:(1)furin靶向基團(tuán)—RVRR肽鏈用于furin識(shí)別剪切;(2)雙硫鍵保護(hù)的半胱氨酸(Cys)提供1,2-氨基硫醇和分子中的2-氰基苯并噻唑(CBT)的氰基部分用于縮合反應(yīng);(3)賴氨酸(Lys)基團(tuán)用于連接CBT和Cys,Lys的側(cè)鏈ε-氨基上連接~(18)F-FBA基團(tuán)用于PET顯像。該探針通過(guò)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的furin識(shí)別攝取進(jìn)入細(xì)胞,剪切水解后發(fā)生縮合反應(yīng)繼而自組裝,從而在腫瘤細(xì)胞內(nèi)控制性地合成放射性納米粒子,濃聚放射性活性,用于腫瘤的靶向PET成像。因納米粒子具有大的表面積和表面積與體積比,可以有效地提高生物組織局部的成像劑濃度,提高成像的靈敏性,已成為PET探針的研究熱點(diǎn)之一。本論文設(shè)計(jì)合成的PET探針具有高度靶向性和智能組裝功能,從而克服了普通納米粒子合成難、攝取率低、靶向性差等問(wèn)題。首先進(jìn)行標(biāo)記前體CKR和無(wú)放射性的冷化合物FBCKR的合成。合成方法簡(jiǎn)便直接,用制備高效液相分離得到純品,進(jìn)行核磁、質(zhì)譜等化學(xué)結(jié)構(gòu)確證。為驗(yàn)證furin控制的酶切和自組裝性能,利用冷化合物FBCKR進(jìn)行體外納米粒子制備。將FBCKR和furin在緩沖液中37℃共孵育,通過(guò)HPLC分離出產(chǎn)物,進(jìn)行質(zhì)譜驗(yàn)證。HPLC圖譜中的峰確證為FBCKR的酶切和縮合產(chǎn)物---二聚體,該條件下的酶切反應(yīng)2h即完成且這種二聚物直到8小時(shí)都穩(wěn)定。將上述培養(yǎng)液直接進(jìn)行SEM和TEM,SEM圖里平均納米直徑為207±99nm,TEM里平均納米直徑為182±70nm。進(jìn)行了~(18)F標(biāo)記合成~(18)F-FBCKR。在多功能合成模塊上全自動(dòng)合成了~(18)F-SFB,再與標(biāo)記前體CKR進(jìn)行反應(yīng),采用HPLC制備分離。進(jìn)行了合成條件的優(yōu)化,最佳的反應(yīng)pH值為7.2,反應(yīng)溫度為50℃,反應(yīng)時(shí)間為0.5h。~(18)F-FBCKR的質(zhì)檢結(jié)果表明該產(chǎn)品符合注射用藥的要求;穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明37℃時(shí)~(18)F-FBCKR在生理鹽水和血清中直到5h都穩(wěn)定。進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證~(18)F-FBCKR和FBCKR的細(xì)胞性能。首先進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證MDA-MB-468細(xì)胞的furin表達(dá)水平,LoVo細(xì)胞作為空白對(duì)照,結(jié)果顯示MDA-MB-468有較強(qiáng)的furin表達(dá)(31.2%的β-actin)而LoVo的furin表達(dá)很弱(10.4%),證明MDA-MB-468適用于本實(shí)驗(yàn)。接著驗(yàn)證了FBCKR的生物相容性,MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物對(duì)細(xì)胞毒性較低。然后將FBCKR與MDA-MB-468腫瘤細(xì)胞在37℃共同培養(yǎng)進(jìn)行了細(xì)胞顯像實(shí)驗(yàn),結(jié)果證明了FBCKR攝取進(jìn)入細(xì)胞后被furin剪切縮合形成了含有熒光素結(jié)構(gòu)的縮合產(chǎn)物,且產(chǎn)物的位置就在furin的位置(高爾基體)上,并且用高倍電鏡直接觀察到納米粒子的生成。~(18)F-FBCKR和MDA-MB-468細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行的攝取實(shí)驗(yàn)顯示培養(yǎng)60min后,細(xì)胞攝取即達(dá)到平衡,攝取率為22.2%,說(shuō)明~(18)F-FBCKR的細(xì)胞攝取能力較好。~(18)F-FBCKR的細(xì)胞洗出實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不加FBCKR組和細(xì)胞共同培養(yǎng)120min后僅有13.1±1.2%的放射性保留,而加5、25、50μM FBCKR組的放射性保留率分別達(dá)到20.3±4.2%,28.5±1.4%,32.1±0.9%。洗出實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FBCKR的加入可以增加化合物的化學(xué)量,飽和細(xì)胞內(nèi)的游離Cys從而保證自組裝的順利進(jìn)行形成放射性納米粒子,增加放射性保留率。最后進(jìn)行了~(18)F-FBCKR的Micro-PET顯像實(shí)驗(yàn)。~(18)F-FBCKR和FBCKR共注射進(jìn)行了MDA-MB-468腫瘤裸鼠的不同時(shí)間點(diǎn)MicroPET掃描,同時(shí)設(shè)立單注射~(18)F-FBCKR組作為對(duì)照。~(18)F-FBCKR組在30和60min腫瘤可見(jiàn)但衰減很快,而共注射組在30-360min腫瘤均清晰可見(jiàn)。放射性數(shù)據(jù)分析顯示~(18)F-FBCKR和FBCKR共注射組的腫瘤攝取分別是~(18)F-FBCKR組的2.5(10 min),3.6(30 min),6.4(60 min),7.9(120 min),8.2(240 min)和6.5倍(360 min)。這些結(jié)果顯示~(18)F-FBCKR有很好的體內(nèi)腫瘤攝取率,但~(18)F-FBCKR和FBCKR共注射有更好的腫瘤攝取和更慢的放射性衰減,進(jìn)一步證明了FBCKR的加入促進(jìn)了化合物在腫瘤區(qū)域的自組裝和放射性納米粒子的形成,增強(qiáng)PET顯像效果。通過(guò)以上的制備和性能研究顯示本論文設(shè)計(jì)的新化合物~(18)F-FBCKR是有應(yīng)用前景的PET探針。
【關(guān)鍵詞】：弗林酶 PET探針 納米粒子 自組裝
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.44;TB383.1
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 主要縮略符號(hào)說(shuō)明7-11
• 第一章 緒論11-31
• 1.1 腫瘤的PET診斷11-18
• 1.1.1 腫瘤的早期診斷11-12
• 1.1.2 PET顯像原理12-14
• 1.1.3 PET顯像的應(yīng)用14-15
• 1.1.4 PET顯像劑15-18
• 1.2 弗林酶與腫瘤18-22
• 1.2.1 Furin簡(jiǎn)介18-20
• 1.2.2 Furin的生物學(xué)功能20-21
• 1.2.3 Furin與腫瘤21
• 1.2.4 Furin抑制劑用于腫瘤治療21-22
• 1.3 納米技術(shù)用于腫瘤診斷22-24
• 1.3.1 納米材料概述22
• 1.3.2 納米材料在腫瘤治療和診斷方面的應(yīng)用22-24
• 1.4 本論文立題依據(jù)、化合物設(shè)計(jì)及主要研究?jī)?nèi)容24-31
• 1.4.1 立項(xiàng)依據(jù)24-28
• 1.4.2 本論文新型PET探針的設(shè)計(jì)28-29
• 1.4.3 研究?jī)?nèi)容29-31
• 第二章 冷化合物FBCKR的合成31-46
• 2.1 引言31-32
• 2.2 試劑與儀器32-33
• 2.2.1 試劑32
• 2.2.2 儀器32-33
• 2.3 化合物FBCKR的合成33-36
• 2.3.1 Ac-Arg-Val-Arg-Arg-Cys(St Bu)-Lys-OH（肽鏈A）合成33-34
• 2.3.2 CKR的合成34-35
• 2.3.3 SFB的合成35
• 2.3.4 FBCKR的合成35-36
• 2.4 結(jié)果與討論36-45
• 2.4.1 肽鏈A的合成36-40
• 2.4.2 反應(yīng)前體CKR、冷化合物FBCKR的合成及結(jié)構(gòu)表征40-44
• 2.4.3 SFB晶體結(jié)構(gòu)表征44-45
• 2.5 本章小結(jié)45-46
• 第三章 體外納米粒子制備以及納米表征46-51
• 3.1 引言46
• 3.2 試劑與儀器46-47
• 3.2.1 試劑46
• 3.2.2 儀器46-47
• 3.3 實(shí)驗(yàn)部分47
• 3.3.1 Furin酶控體外納米粒子制備47
• 3.3.2 納米結(jié)構(gòu)表征47
• 3.4 結(jié)果與討論47-50
• 3.4.1 納米粒子制備及HPLC解析47-49
• 3.4.2 納米結(jié)構(gòu)表征49-50
• 3.5 本章小結(jié)50-51
• 第四章 ~(18)F-FBCKR的合成51-76
• 4.1 引言51-52
• 4.2 試劑與儀器52-53
• 4.2.1 試劑52
• 4.2.2 儀器52-53
• 4.3 合成過(guò)程53-60
• 4.3.1 ~(18)F-FDG合成53-56
• 4.3.2 ~(18)F-SFB合成56-58
• 4.3.3 ~(18)F-FBCKR合成58-60
• 4.4 ~(18)F-FBCKR的質(zhì)檢及穩(wěn)定性研究60-61
• 4.4.1 pH值測(cè)定60
• 4.4.2 氨基聚醚(K222)雜質(zhì)含量測(cè)定60
• 4.4.3 放射性比活度測(cè)定60
• 4.4.4 放射化學(xué)純度測(cè)定60-61
• 4.4.5 穩(wěn)定性研究61
• 4.5 結(jié)果與討論61-74
• 4.5.1 ~(18)F-FDG合成61-66
• 4.5.2 ~(18)F-SFB合成66
• 4.5.3 ~(18)F-FBCKR合成及合成條件選擇66-67
• 4.5.4 ~(18)F-FBCKR的質(zhì)檢及穩(wěn)定性研究結(jié)果67-74
• 4.6 本章小節(jié)74-76
• 第五章 ~(18)F-FBCKR和FBCKR的細(xì)胞顯像和細(xì)胞攝取研究76-89
• 5.1 引言76
• 5.2 試劑與儀器76-77
• 5.2.1 試劑和細(xì)胞76
• 5.2.2 儀器76-77
• 5.3 細(xì)胞培養(yǎng)77
• 5.3.1 細(xì)胞復(fù)蘇77
• 5.3.2 細(xì)胞傳代77
• 5.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)77-80
• 5.4.1 Western blot實(shí)驗(yàn)77-78
• 5.4.2 FBCKR細(xì)胞毒性測(cè)定78
• 5.4.3 FBCKR細(xì)胞顯像78-79
• 5.4.4 FBCKR細(xì)胞納米驗(yàn)證79
• 5.4.5 ~(18)F-FBCKR細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)79
• 5.4.6 ~(18)F-FBCKR和FBCKR細(xì)胞洗脫實(shí)驗(yàn)79-80
• 5.5 結(jié)果與討論80-87
• 5.5.1 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果80-82
• 5.5.2 FBCKR細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果82-83
• 5.5.3 FBCKR細(xì)胞顯像圖及解析83-84
• 5.5.4 FBCKR細(xì)胞納米驗(yàn)證84-85
• 5.5.5 ~(18)F-FBCKR細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果85-86
• 5.5.6 ~(18)F-FBCKR和FBCKR細(xì)胞洗脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果86-87
• 5.6 本章小結(jié)87-89
• 第六章 ~(18)F-FBCKR和FBCKR的裸鼠Micro-PET顯像研究89-93
• 6.1 引言89
• 6.2 試劑與儀器89
• 6.2.1 動(dòng)物和試劑89
• 6.2.2 儀器89
• 6.3 荷瘤裸鼠Micro-PET顯像實(shí)驗(yàn)89-90
• 6.3.1 裸鼠MDA-MB-468腫瘤模型的建立89
• 6.3.2 荷瘤裸鼠Micro-PET顯像89-90
• 6.4 結(jié)果與討論90-92
• 6.4.1 裸鼠MDA-MB-468腫瘤模型的建立90
• 6.4.2 荷瘤裸鼠Micro-PET顯像結(jié)果90-92
• 6.5 本章小結(jié)92-93
• 主要結(jié)論與展望93-94
• 主要結(jié)論93-94
• 展望94
• 本論文創(chuàng)新點(diǎn)94-95
• 致謝95-96
• 參考文獻(xiàn)96-102
• 附錄: 作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的論文102

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7 唐麗麗;兩親性短肽的自組裝及其應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D];華南理工大學(xué);2012年

8 崔國(guó)良;金屬表面超細(xì)顆粒自組裝改性及抗結(jié)垢性能[D];天津大學(xué);2006年

9 朱進(jìn)清;DNA自組裝增強(qiáng)信號(hào)的生物傳感器研究[D];湖南大學(xué);2011年

10 麻晶晶;DNA自組裝計(jì)算模型及其應(yīng)用[D];陜西師范大學(xué);2012年

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本文編號(hào)：864798