本文關(guān)鍵詞：內(nèi)皮祖細(xì)胞和p38 MAPK抑制劑聯(lián)合治療糖尿病小鼠缺血性腦卒中及其影像學(xué)評價

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【摘要】：第一部分p38 MAPK抑制劑體外影響高糖環(huán)境中內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的實驗研究目的 本實驗旨在分離、培養(yǎng)及鑒定小鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs),體外驗證高糖環(huán)境對EPCs功能的影響,觀察p38 MAPK抑制劑是否可以改善高糖環(huán)境中EPCs功能,并比較新型抑制劑RWJ 67657與傳統(tǒng)抑制劑SB 203580體外保護(hù)EPCs的效能。材料和方法 采用密度梯度離心法從小鼠骨髓中分離培養(yǎng)出EPCs,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫熒光染色、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物及體外成管能力多方位鑒定EPCs特性。用含不同濃度葡萄糖的培養(yǎng)液體外培養(yǎng)EPCs,通過MTT、β-半乳糖甘酶細(xì)胞衰老、Annexin V細(xì)胞凋亡、細(xì)胞粘附、遷移、成管及ELISA實驗觀察高糖對EPCs數(shù)量及功能的影響。在高糖培養(yǎng)液(25mM)中分別加入RWJ 67657 (1μM)和SB 203580 (1μM), Western Blot測定p38 MAPK磷酸化水平,并通過上述一系列細(xì)胞實驗比較EPCs數(shù)量及功能的變化。結(jié)果 免疫熒光、流式細(xì)胞儀檢測及體外成管實驗結(jié)果顯示,培養(yǎng)第14天的細(xì)胞CD133、CD34和VEGFR2表達(dá)均呈陽性,并且在基質(zhì)膠上能夠形成典型的管腔樣結(jié)構(gòu)。體外培養(yǎng)的EPCs在高糖環(huán)境中增殖能力明顯下降,而且隨著葡萄糖濃度越高,細(xì)胞增殖能力下降程度越高,與甘露醇對照組相比差異顯著(P0.05)。Western Blot顯示隨著葡萄糖濃度的增加,EPCs的p38 MAPK磷酸化水平逐漸增加,而RWJ 67657和SB 203580可以顯著降低細(xì)胞p38 MAPK的磷酸化水平(P0.05)。細(xì)胞凋亡和成管實驗顯示p38 MAPK抑制劑可以明顯改善高糖對EPCs存活及成管能力的影響,且RWJ 67657較SB 203580效果更為顯著(P0.05)。此外,p38 MAPK抑制劑能夠顯著降低高糖對EPCs衰老、粘附、遷移及VEGF分泌的影響(P0.05)。結(jié)論 體外培養(yǎng)的小鼠骨髓源性細(xì)胞大部分具有造血干細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞特性,符合EPCs生物學(xué)特性,能在體外增殖并分化為內(nèi)皮細(xì)胞。葡萄糖呈量效性減少EPCs數(shù)量并影響其功能,兩種p38 MAPK抑制劑均可以改善高糖環(huán)境中EPCs功能,且新型抑制劑RWJ 67657與傳統(tǒng)抑制劑SB 203580相比,保護(hù)EPCs的效能更高、毒性更低。第二部分多功能分子影像探針在野生型和糖尿病型缺血性腦卒中模型鼠中活體示蹤內(nèi)皮祖細(xì)胞的實驗研究目的應(yīng)用磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)和近紅外熒光成像(near-infrared fluorescence imaging, NIRFI)動態(tài)監(jiān)測移植的外源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs),觀察其在野生型及2型糖尿病腦卒中模型鼠體內(nèi)的歸巢現(xiàn)象,并在活體狀態(tài)下評估p38 MAPK抑制劑RWJ 67657對EPCs歸巢的影響。材料和方法 構(gòu)建多功能分子影像探針,以順磁性螯合物和熒光基團(tuán)修飾,體外標(biāo)記培養(yǎng)的小鼠骨髓源性EPCs。將探針標(biāo)記的或未標(biāo)記的EPCs經(jīng)患側(cè)頸內(nèi)動脈泵入野生型或2型糖尿病小鼠缺血性腦卒中模型體內(nèi),移植的細(xì)胞量約為106(100μ1),分別于移植后1、3、5、7、10、14天不同時間點進(jìn)行MR和NIRF成像,成像結(jié)束后處死小鼠,電感耦合等離子體質(zhì)譜儀定量腦組織中的Gd含量,并通過免疫熒光染色在離體水平觀察EPCs遷移及歸巢情況。結(jié)果MRI和NIRFI結(jié)果顯示,野生型模型鼠腦缺血部位的信號強(qiáng)度在探針標(biāo)記的EPCs移植后第5天達(dá)到峰值,其病灶處信號強(qiáng)度及離體組織Gd含量與探針未標(biāo)記的EPCs移植組相比具有顯著差異性(P0.05)。免疫熒光染色顯示探針標(biāo)記的EPCs移植后第5天,在腦組織微血管中可以觀察到CD 133、CD34、VEGFR2與探針中羅丹明共染的雙陽性細(xì)胞,說明部分EPCs確實歸巢至腦缺血部位。此外,在探針標(biāo)記的EPCs移植后第5天,糖尿病小鼠腦缺血部位MR和NIRF成像信號強(qiáng)度均顯著低于野生型小鼠(P0.05)。而RWJ 67657連續(xù)灌胃顯著增加糖尿病小鼠腦缺血部位的信號強(qiáng)度(P0.05),提示更多的外源性EPCs遷移歸巢至腦缺血部位。結(jié)論 本實驗所建立的雙模態(tài)成像方法可以用于在體無創(chuàng)監(jiān)測移植的外源性EPCs。通過該多模態(tài)成像方法,觀察到2型糖尿病明顯降低外源性EPCs歸巢至腦缺血部位的數(shù)量,連續(xù)RWJ 67657灌胃治療卻能夠促使更多的外源性EPCs歸巢至糖尿病小鼠腦缺血部位。第三部分內(nèi)皮祖細(xì)胞移植和p38 MAPK抑制劑聯(lián)合治療糖尿病小鼠缺血性腦卒中的實驗研究目的本實驗旨在通過T2加權(quán)成像(T2-weighted imaging, T2WI)和彌散張量成像(diffusion tensor imaging, DTI),結(jié)合組織病理學(xué)方法研究內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)移植和RWJ 67657聯(lián)合治療對糖尿病小鼠缺血性腦卒中預(yù)后的作用。方法小鼠骨髓源性EPCs(約106個)經(jīng)患側(cè)頸內(nèi)動脈移植入2型糖尿病小鼠缺血性腦卒中模型體內(nèi),RWJ 67657自建模前30min起連續(xù)灌胃7天(每天1次、每次50 mg/kg)。分別在建模前及建模后第1、7、14、21天進(jìn)行模型鼠神經(jīng)功能評分；在建模后第7天進(jìn)行T22WI掃描、Western Blot及免疫組化染色；在建模后14天進(jìn)行DTI掃描及髓鞘堿性蛋白免疫組化染色。結(jié)果單獨EPCs移植或RWJ灌胃治療均不能顯著改善糖尿病小鼠缺血性腦卒中的預(yù)后,盡管RWJ 67657表現(xiàn)出顯著的抗炎作用(P0.05)。RWJ灌胃及EPCs移植聯(lián)合治療卻可以顯著協(xié)同促進(jìn)糖尿病腦卒中后的血管新生(P0.05)及神經(jīng)發(fā)生(P0.05)。聯(lián)合治療組小鼠在建模第7天Western B lot證實VEGF及BDNF的表達(dá)明顯增加、T2WI顯示腦梗塞體積顯著降低,第14天DTI顯示腦白質(zhì)纖維數(shù)量增加,第21天神經(jīng)功能缺陷明顯改善(P0.05)。結(jié)論 活體磁共振成像及離體組織學(xué)證實EPCs移植和RWJ 67657聯(lián)合治療可以加速糖尿病小鼠缺血性腦卒中的恢復(fù),而且這可能是由于促神經(jīng)、血管因子的表達(dá)增加引起。
【關(guān)鍵詞】：骨髓 內(nèi)皮祖細(xì)胞 高糖 p38 MAPK抑制劑 RWJ 67657 SB 203580 糖尿病 缺血性腦卒中 內(nèi)皮祖細(xì)胞 分子影像 納米探針 p38 MAPK 糖尿病 缺血性腦卒中 內(nèi)皮祖細(xì)胞 細(xì)胞移植 p38 MAPK 炎癥
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1;R743.3;R445.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-12
• 縮略詞表12-15
• 前言15-18
• 文獻(xiàn)綜述18-26
• 技術(shù)路線圖26-27
• 第一部分 p38 MAPK抑制劑體外影響氋糖環(huán)境中內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的實驗研究27-46
• 1 材料與方法27-36
• 2 實驗結(jié)果36-42
• 3 討論42-45
• 4 小結(jié)45-46
• 第二部分 多功能分子影像探針在野生型和糖尿病型缺血性腦卒中模型鼠中活體示蹤內(nèi)皮祖細(xì)胞的實驗研究46-61
• 1 材料與方法46-52
• 2 實驗結(jié)果52-58
• 3 討論58-59
• 4 小結(jié)59-61
• 第三部分 內(nèi)皮祖細(xì)胞移植和p38 MAPK抑制劑聯(lián)合治療糖尿病小鼠缺血性腦卒中的實驗研究61-76
• 1 材料與方法61-69
• 2 實驗結(jié)果69-73
• 3 討論73-75
• 4 小結(jié)75-76
• 全文總結(jié)76-77
• 參考文獻(xiàn)77-92
• 個人簡介92-93
• 博士在讀期間發(fā)表文章及會議摘要93-95
• 致謝95

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本文編號：836384