本文關(guān)鍵詞：輻射誘導非小細胞肺癌CHMP4C表達及其機制研究

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【摘要】：背景肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率與死亡率非常高的惡性腫瘤。非小細胞肺癌占肺癌的85%左右。放射治療是晚期非小細胞肺癌的主要治療方式。肺腺癌對于放射治療的敏感性相對較低。如何提高肺腺癌病人的放療療效,為病人制定更為特異和優(yōu)化的治療方案從而更好的提高患者的生存率,是非常重要且廣受關(guān)注的問題。最近的研究發(fā)現(xiàn),作為內(nèi)涵體分選復合物-Ⅲ(ESCRT-Ⅲ)的一個亞基,CHMP4C在細胞分裂最后階段的細胞剪切檢查點(Abscission checkpoint)中發(fā)揮著關(guān)鍵性的監(jiān)控作用。CHMP4C基因主要負責暫時中止剪切過程直至“滯后”染色體完全分離并進入到新的細胞中,以防止細胞過早分離,從而阻止遺傳損害的發(fā)生。CHMP4C的這一功能,主要受AuroraB的精確調(diào)控來得以實現(xiàn)。而且CHMP4C在正常組織中低表達,而在腫瘤細胞中高表達。然而,輻射對CHMP4C表達的影響,CHMP4C在輻射誘導的細胞響應中的功能,以及對非小細胞肺癌輻射敏感性的影響及其機制仍然不清楚。目的本研究旨在探討輻射誘導CHMP4C表達及其機制。分析輻射誘導CHMP4C表達情況以及CHMP4C在輻射誘導的細胞響應中的功能。并通過研究CHMP4C與p53或AuroraB介導的信號傳導通路之間的關(guān)系,進一步探尋CHMP4C參與非小細胞肺癌輻射敏感性的機制,為提高非小細胞肺癌的放射治療療效提供新的參考和依據(jù)。方法1. CHMP4C對A549細胞活性、細胞凋亡和細胞周期的影響。A549細胞轉(zhuǎn)染siCHMP4C 48h后,alamarBlue檢測細胞活性；caspase-GloR 3/7 reagent檢測caspase 3/7活性；流式細胞術(shù)分析細胞凋亡和細胞周期；Western blot檢測細胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白Cyclin A, Rb, Cyclin B1和cdc2的蛋白表達水平。2. AuroraB對CHMP4C的調(diào)控作用。A549(p53+/+)和H1299(p53-/-)細胞轉(zhuǎn)染siAuroraB或siCHMP4C 48h后,Western blot檢測AuroraB和CHMP4C的蛋白表達水平,Real-time PCR檢測AuroraB和CHMP4C的mRNA表達水平。AZD1152-HQPA抑制A549和H1299細胞的AuroraB功能后,Western blot檢測CHMP4C的磷酸化水平。A549和H1299細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-AuroraB以高表達AuroraB, Western blot檢測AuroraB蛋白表達水平和CHMP4C的磷酸化水平。3.輻射對CHMP4C和AuroraB表達的影響。A549和H1299細胞接受2Gy照射后不同時間點(0,4,8,24,48h),或接受不同劑量(0,2,4,6Gy)照射后24h,Western blot分析CHMP4C蛋白表達水平和磷酸化水平以及AuroraB蛋白表達水平。A549細胞轉(zhuǎn)染sip53后接受2Gy照射,Western blot檢測p53和CHMP4C的蛋白表達。4. AuroraB或CHMP4C對細胞輻射敏感性的影響。A549和H1299細胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-AuroraB/CHMP4C或si-AuroraB/CHMP4C后,接受不同劑量(0,2,4,6Gy)照射,使用克隆形成實驗檢測AuroraB或CHMP4C對細胞輻射敏感性的影響。5. CHMP4C對輻射誘導的細胞周期和細胞凋亡的影響。A549和H1299細胞轉(zhuǎn)染sip21或siCHMP4C 24h后接受2Gy照射,照射后24h利用流式細胞術(shù)分析細胞周期進程,Western blot檢測A549細胞p21和CHMP4C的表達；A549細胞轉(zhuǎn)染siCHMP4C 24h后接受6Gy照射,照射后24h利用流式細胞術(shù)分析細胞凋亡。6. CHMP4C對DNA損傷修復能力的影響。細胞轉(zhuǎn)染siCHMP4C 24h后接受4Gy照射,照射后30min利用熒光顯微鏡檢測yH2AX和53BP1焦點形成。結(jié)果1.CHMP4C對A549細胞活性、細胞凋亡和細胞周期的影響。與對照組相比,抑制CHMP4C可以降低細胞活性,增強Caspase3/7活性,促進細胞凋亡,引起細胞周期S相延遲并增強Rb和cdc2的磷酸化水平,提高CyclinBl的表達水平,降低CyclinA2的表達水平。2. AuroraB對CHMP4C的調(diào)控作用。沉默AuroraB表達后,CHMP4C的蛋白表達水平明顯降低,CHMP4C的mRNA表達水平?jīng)]有發(fā)生變化。然而沉默CHMP4C對AuroraB的蛋白表達水平?jīng)]有影響。高表達AuroraB可以提高CHMP4C的磷酸化水平而抑制AuroraB的功能可以降低CHMP4C的磷酸化水平。3.輻射對CHMP4C和AuroraB表達的影響。細胞接受2,4,6Gy照射后,A549細胞中CHMP4C蛋白表達水平增高并在24h達到最高水平,而H1299細胞中CHMP4C蛋白表達水平卻沒有增高,但是A549和H1299細胞中CHMP4C磷酸化水平和AuroraB表達水平均增高。細胞接受照射后,缺失p53功能的A549細胞中CHMP4C蛋白表達水平?jīng)]有增高。4. AuroraB或CHMP4C對細胞輻射抗敏感性的影響。在克隆形成實驗中,與單純轉(zhuǎn)染siCHMP4C組和單純照射組細胞相比,沉默CHMP4C并接受照射組細胞存活分數(shù)明顯下降,然而高表達CHMP4C組的細胞存活分數(shù)升高。同時,在AuroraB沉默或高表達細胞中出現(xiàn)了相似的結(jié)果。5. CHMP4C對輻射誘導的細胞周期和細胞凋亡的影響。抑制A549和H1299細胞CHMP4C表達可以誘導細胞周期S相延遲。與單純抑制CHMP4C表達相比,抑制CHMP4C表達后再接受2Gy照射組細胞表現(xiàn)出更為嚴重的S相延遲。同時,抑制A549細胞中p21的表達可以引起相似的現(xiàn)象。此外,沉默CHMP4C不會影響p21蛋白表達,沉默p21也不會影響CHMP4C蛋白表達。并且,同時沉默CHMP4C和p21表達會引起S相延遲的疊加效應。相對于單純抑制CHMP4C組和單純照射6Gy組細胞,抑制CHMP4C表達聯(lián)合6Gy照射組的細胞凋亡更為嚴重。6. CHMP4C對DNA損傷修復能力的影響。抑制CHMP4C表達可以降低H2AX的磷酸化水平,減少γH2AX和53BP1焦點招募到DNA損傷處,從而影響DNA損傷修復的能力。結(jié)論1.抑制CHMP4C表達能夠降低A549細胞的增殖能力；2.抑制CHMP4C表達可以增強非小細胞肺癌的輻射敏感性；3. CHMP4C介導非小細胞肺癌輻射敏感性的功能與AuroraB信號傳導通路相關(guān),可能不依賴于p53。
【關(guān)鍵詞】：CHMP4C AuroraB 非小細胞肺癌 輻射
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2;R730.55
【目錄】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 英文縮略詞表13-14
• 引言14-16
• 第一章 緒論16-38
• 1. 非小細胞肺癌治療研究進展概述16-17
• 2. 輻射增敏相關(guān)研究17-31
• 3. CHMP4C相關(guān)研究進展31-38
• 第二章 材料與方法38-50
• 1. 主要材料與試劑38-39
• 2. 儀器設(shè)備39-40
• 3. 實驗方法40-49
• 4. 統(tǒng)計學分析49-50
• 第三章 結(jié)果50-65
• 1. CHMP4C在非小細胞肺癌A549細胞中的功能研究50-53
• 2. AuroraB對CHMP4C的調(diào)控作用53-55
• 3. CHMP4C影響非小細胞肺癌輻射敏感性及相關(guān)機制研究55-60
• 4. p53缺失對輻射誘導的CHMP4C表達及其功能影響的研究60-65
• 第四章 討論65-79
• 1. CHMP4C在非小細胞肺癌A549細胞中的功能分析66-70
• 2. CHMP4C對非小細胞肺癌輻射敏感性的影響70-72
• 3. CHMP4C對DNA損傷修復的影響72-73
• 4. CHMP4C介導非小細胞肺癌輻射敏感性的機制分析73-75
• 5. 本研究中涉及的信號傳導通路探討75-79
• 第五章 總結(jié)和展望79-80
• 1. 結(jié)論79
• 2. 創(chuàng)新點79
• 3. 展望79-80
• 參考文獻80-109
• 作者簡介109-110
• 致謝110

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