本文關(guān)鍵詞：構(gòu)建和鑒定靶向穿膜的多功能分子探針iCREKA

  更多相關(guān)文章： iCREKA 膠質(zhì)瘤 分子影像 熒光成像 microPET/CT顯像

【摘要】：目的：一、合成環(huán)狀分子探針iCREKA,驗(yàn)證該環(huán)肽的靶向性和穿膜能力,為進(jìn)一步的探針制備和腫瘤靶向顯像奠定基礎(chǔ)。二、用異硫氰酸熒光素(fluorecein isothiocyante,FITC)標(biāo)記環(huán)肽制備熒光探針(FITC-iCREKA),用熒光成像方法研究該熒光探針能否使腫瘤顯像,評價(jià)該探針能否發(fā)展成為腫瘤的靶向熒光分子探針。三、用正電子核素18F標(biāo)記環(huán)肽iCREKA制備PET分子探針(18F-iCREKA),通過用：microPET/CT顯像,探索并評價(jià)該探針用于腫瘤PET/CT顯像的可行性。方法：一、環(huán)狀分子探針iCREKA的合成及靶向性和穿膜作用的驗(yàn)證1.環(huán)狀分子探針iCREKA的化學(xué)合成先采用固相9-芴甲氧羰基(Fmoc)肽化學(xué)合成方法合成線性多肽CREKAPLGLAGRKKRRQRRRC。以2—氯三苯基氯樹脂為載體,配合Fmoc氨基保護(hù)策略,按照氨基酸序列從羧基端(C端)至氨基端(N端)按順序添加氨基酸,首先將C端第一個(gè)氨基酸即Cys的羧基以共價(jià)鍵的形式與樹脂相連,再以Cys的氨基為合成起點(diǎn),使其與Arg的羧基發(fā)生�；磻�(yīng),形成肽鍵。反應(yīng)結(jié)束后用適量的吡啶和乙酸酐封閉樹脂上剩余的活性位點(diǎn)。后續(xù)氨基酸以HOBt/HBTU/DIEA為縮合劑依次連接,直至合成整條線性多肽。然后將首尾兩個(gè)Cys進(jìn)行環(huán)化處理,環(huán)化后再將一個(gè)賴氨酸,連在C末端。為增加iCREKA的穩(wěn)定性,對其進(jìn)行N端乙�；揎�。反應(yīng)結(jié)束后,以三氟乙酸為主切割劑將目的肽段從樹脂上裂解下來,合成產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分離、純化、分析,質(zhì)譜分析鑒定。2.異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記iCREKA將異硫氰酸熒光素(FITC)與環(huán)肽iCREKA的末端賴氨酸相反應(yīng)而制備熒光標(biāo)記多肽探針FITC-iCREKA.在采用固相9-芴甲氧羰基(Fmoc)肽化學(xué)合成方法合成環(huán)肽iCREKA后,將FITC連于末位賴氨酸的氨基。即用碳酸氫鈉緩沖液pH9.8稀釋Fmoc-Lys-OH為5mg/ml放入透析袋,將透析袋放入100ml含0.1 mg/ml FITC的pH9.8碳酸氫鈉緩沖液(新配制)的燒杯中,用鋁鉑包燒杯以避光,4℃攪拌過夜；上述溶液對PBS在4℃透析以終止反應(yīng),其間至少更換PBS液三次,直致480nm的吸收為零；加入0.5g/L的疊氮鈉。反應(yīng)結(jié)束后,以三氟乙酸為主切割劑將目的肽段從樹脂上裂解下來,合成產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分離、純度,質(zhì)譜分析鑒定。3.對照肽FITC-CREKA的合成先按固相肽合成方法合成對照肽CREKA,再將FITC標(biāo)記在賴氨酸的側(cè)鏈氨基上。4.MMP-2對FITC-iCREKA細(xì)胞穿膜能力的作用的驗(yàn)證(1)加入金屬蛋白酶2(MMP-2)后與腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)：a.細(xì)胞準(zhǔn)備：選用裸鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87。膠質(zhì)瘤U87腫瘤細(xì)胞株在5%CO2,37℃,含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí),用2ml含0.25%EDTA的胰酶消化2分鐘,含血清培養(yǎng)基中和胰酶,傳代至35mm培養(yǎng)皿,待細(xì)胞貼壁時(shí)備用。b.MMP-2活化：取80μL 0.7mg/ml鼠源性MMP2/Tris.HCl溶液,加入0.1ml2.5mmol/L4-APMA,37℃水浴箱中孵育2hr。c.熒光檢測：取100 μl0.7mg/ml活性MMP-2/1640溶液,加入0.9ml新鮮配置無血清細(xì)胞培養(yǎng)基熒光素探針FITC-iCREKA 10mg/ml溶液,過濾除菌,分別加入1ml至上述細(xì)胞培養(yǎng)皿,37℃孵育60min后,PBS沖洗培養(yǎng)皿(5min×3次),75%酒精固定,DAPI染色后,置于熒光顯微鏡下觀察活細(xì)胞內(nèi)熒光的分布情況。胰酶消化,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光攝取強(qiáng)度。(2)未加入MMP-2時(shí)與腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)：a.細(xì)胞準(zhǔn)備：選用裸鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87。膠質(zhì)瘤U87腫瘤細(xì)胞株在5%CO2,37℃,含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí),用2ml含0.25%EDTA的胰酶消化2分鐘,含血清培養(yǎng)基中和胰酶,傳代至35mm培養(yǎng)皿,待細(xì)胞貼壁時(shí)備用。b.熒光檢測：加入與上述實(shí)驗(yàn)相同量的熒光素探針FITC-iCREKA,過濾除菌,分別加入1ml至上述細(xì)胞培養(yǎng)皿,37℃孵育60min后,PBS沖洗培養(yǎng)皿(5min×3次)后,置于熒光顯微鏡下觀察活細(xì)胞內(nèi)熒光的分布情況。胰酶消化,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光攝取強(qiáng)度。(3)對照肽FITC-CREKA與腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)按照與實(shí)驗(yàn)4相同的方法,將U87細(xì)胞與對照肽FITC-CREKA進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn),用熒光顯微鏡觀察加入MMP-2和未加入MMP-2細(xì)胞內(nèi)熒光的分布情況。胰酶消化,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光攝取強(qiáng)度。5.荷腦膠質(zhì)瘤U87裸鼠腫瘤模型的建立和確認(rèn)(1)荷腦膠質(zhì)瘤U87裸鼠腫瘤模型的建立采用裸鼠腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株。取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞,用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化3分鐘后,1000rpm離心5min,棄上清,加入無菌的PBS,輕輕吹打使之成為單細(xì)胞懸液,取一滴細(xì)胞懸液滴在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù),并用PBS將濃度調(diào)整為1×106個(gè)細(xì)胞/0.2ml的細(xì)胞懸液。取4-6周齡的雌性裸鼠,用75%的酒精棉球在裸鼠右側(cè)腋窩消毒,用胰島素注射器在消毒部位皮下注射上述細(xì)胞懸液,注射劑量為0.2ml/只。SPF條件下飼養(yǎng),當(dāng)瘤體直徑長至1cm,將裸鼠麻醉,剖出腫瘤組織,小心去除腫瘤包膜,將腫瘤組織切成小塊,用接種針將組織接種到右側(cè)腋窩皮下。共接種40只裸鼠,觀察成瘤情況。待腫瘤直徑達(dá)5-10mm時(shí),用于實(shí)驗(yàn)研究。(2)組織病理學(xué)檢查將成瘤的裸鼠處死,分離取出腫瘤組織,做石蠟切片,進(jìn)行HE染色,然后用正置顯微鏡觀察是否為腦膠質(zhì)瘤。6.FITC-iCREKA在腫瘤模型體內(nèi)靶向性的驗(yàn)證取荷腦膠質(zhì)瘤裸鼠的尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150 ul),于注射后1小時(shí)處死動物,分離腫瘤組織,迅速做冰凍切片。用兔源性抗纖維蛋白原抗體做一抗,Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG為二抗,做免疫熒光。置于熒光顯微鏡下觀察纖維蛋白原及FITC-iCREKA在腫瘤組織內(nèi)的分布情況。7.腫瘤組織內(nèi)金屬蛋白酶-2(MMP-2)免疫熒光成像取荷腦膠質(zhì)瘤裸鼠的尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150 μl),于注射后1小時(shí)處死動物,分離腫瘤組織,迅速做冰凍切片。然后用鼠源性抗MMP-2抗體做一抗,Cy3標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為二抗,做免疫熒光。并用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色。然后置于熒光顯微鏡下觀察MMP-2及FITC-iCREKA在腫瘤組織內(nèi)的分布情況。8.FITC-iCREKA在腫瘤組織內(nèi)的攝取及分布研究經(jīng)荷膠質(zhì)瘤裸鼠的尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150 μl),分別于1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、4小時(shí)、5小時(shí)、6小時(shí)后處死動物,分離腫瘤組織,做冰凍切片,用DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)染色后,置于熒光顯微鏡下觀察各時(shí)間點(diǎn)FITC-iCREKA在腫瘤組織內(nèi)的分布情況。對照組：經(jīng)荷瘤鼠尾靜脈注射對照肽FITC-CREKA (1mM,150 μl),在相同時(shí)間點(diǎn)處死動物,分離腫瘤組織,做冰凍切片、DAPI染色后,熒光顯微鏡下觀察腫瘤組織內(nèi)的熒光分布情況。二、腫瘤模型FITC-iCREKA熒光成像研究1. FITC-iCREKA在荷膠質(zhì)瘤腫瘤模型體內(nèi)的熒光生物學(xué)分布研究(1) FITC-iCREKA腫瘤熒光成像取荷膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株的裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150μl),1小時(shí)后脫頸處死動物,分離取出腫瘤及腦、心臟、肝臟、脾臟、雙肺、雙腎、腸道等組織,用生理鹽水充分沖洗各組織、臟器表面以去除污染,然后依次擺放于干凈的培養(yǎng)皿中,置于熒光成像儀內(nèi)成像,觀察腫瘤及各臟器、組織的熒光分布,并通過勾畫ROI測量熒光攝取量,比較腫瘤與正常組織對FITC-iCREKA的攝取差異。(2)對照肽FITC-CREKA荷瘤裸鼠腫瘤及腦組織成像取荷膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株的裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射FITC-CREKA (1mM,150μl),1小時(shí)后脫頸處死動物,分離取出腫瘤及腦、心臟、肝臟、脾臟、雙肺、雙腎、腸道等組織,用生理鹽水充分沖洗各組織、臟器表面以去除污染,然后依次擺放于干凈的培養(yǎng)皿中,置于熒光成像儀內(nèi)成像,觀察腫瘤及各臟器、組織的熒光分布,并通過勾畫ROI測量熒光攝取量,比較腫瘤與正常組織對FITC-CREKA的攝取差異。2.荷膠質(zhì)瘤腫瘤模型冠狀斷層成像取荷膠質(zhì)瘤U87裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150μl),暗室放置1小時(shí)后脫頸處死,置于-80冰箱過夜,次日將動物進(jìn)行冠狀位切層,暴露腫瘤組織后將動物置于潔凈的培養(yǎng)皿,用熒光成像儀進(jìn)行成像觀察各個(gè)組織、臟器及腫瘤內(nèi)熒光分布情況。3.熒光成像分析用熒光顯像儀Kodak In-Vivo Imaging System F配置的Kodak MI分析軟件進(jìn)行圖像分析。在熒光圖像上沿腫瘤和各組織的邊緣勾畫感興趣區(qū)(Region of interest, ROI),測量各感興趣區(qū)內(nèi)的熒光計(jì)數(shù),計(jì)算腫瘤與正常組織的腫瘤/非腫瘤比值Otumor/non-tumor, T/NT ratios)。三、PET分子探針18F-iCREKA的合成和PET/CT顯像研究1.合成18F-iCREKA以2-溴丙酸乙酯為前體,經(jīng)過18F親核取代、氫氧化鉀水解,再與二對硝基苯碳酸酯(NPC)反應(yīng)得到活化的18F-NFP,多肽與18F-NFP在無水二甲基亞砜(DMSO)溶劑中,以二異丙基乙基胺(DIPEA)為堿,40℃下反應(yīng)5min,多步驟反應(yīng)合成18F-FP-iCREKA。用0.22μm微孔濾膜去除細(xì)菌。然后用HPLC和放射性薄層層析法(TLC)測定其化學(xué)純度和放化純度�？偡磻�(yīng)時(shí)間為180分鐘,放化純度為97%。2. micro PET/CT 顯像：取荷膠質(zhì)瘤U87裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射18F-iCREKA顯像劑5.50-7.40MBq(150～200μCi),用異氟醚麻醉后分別于30分鐘、60分鐘及120分鐘行microPET/CT顯像(圖像采集時(shí)間為10分鐘),觀察腫瘤及各組織對18F-iCREKA的攝取情況。所用儀器為Inveon microPET/CT掃描儀(SIEMENS, Germany)。圖像均采用3維的有序子集最大期望值法(ordered subsets expectation maximum, OSEM)進(jìn)行圖像重建并用CT進(jìn)行衰減校正。3. microPET/CT圖像分析采用microPET/CT配置的Syngo分析軟件,在PET圖像上沿腫瘤和各組織的邊緣勾畫感興趣區(qū),測量各感興趣區(qū)內(nèi)的放射性計(jì)數(shù),計(jì)算腫瘤與正常組織的腫瘤/非腫瘤比值。四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,加入MMP-2和未加入MMP-2時(shí)熒光強(qiáng)度比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；加入MMP-2后FITC-iCREKA與對照肽熒光強(qiáng)度比較采用兩獨(dú)立樣本t經(jīng)驗(yàn)；FITC-iCREKA與對照肽腫瘤/非腫瘤比值比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；P0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：一、環(huán)狀分子探針iCREKA的合成及靶向性和穿膜作用的驗(yàn)證1.環(huán)狀分子探針iCREKA的化學(xué)合成固相合成的環(huán)狀分子探針iCREKA呈現(xiàn)為白色粉末。經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定,主峰分子量(m/z：Da)為2668.8,與iCREKA的理論分子量2665.26相符,證明合成正確。經(jīng)HPLC純化、分析結(jié)果顯示iCREKA的純度為98.27%。2.異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記iCREKAFITC-iCREKA合成后產(chǎn)物為粉黃色粉末。質(zhì)譜分析鑒定,FITC-iCREKA的主峰分子量(m/z,Da)為3170,與FITC-iCREKA的理論分子量3167.81相符,證明標(biāo)記成功。經(jīng)HPLC純化、分析結(jié)果顯示FITC-iCREKA純度為98.23%。3.對照肽FITC-CREKA的合成FITC-CREKA合成后產(chǎn)物為粉黃色粉末。質(zhì)譜分析鑒定,FITC-CREKA的主峰分子量(m/z,Da)為993,6,與FITC-CREKA的理論分子量995.09相符,證明標(biāo)記成功。經(jīng)HPLC純化、分析結(jié)果顯示FITC-iCREKA純度為98.66%。4.MMP-2對FITC-iCREKA細(xì)胞穿膜能力的作用的驗(yàn)證(1)加入金屬蛋白酶2(MMP-2)后與腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)：經(jīng)酒精固定和DAPI染色后,置于倒置顯微鏡下,首先用藍(lán)光激發(fā)可見U87細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)高強(qiáng)度的綠色熒光；用藍(lán)紫色光激發(fā)可見深藍(lán)色細(xì)胞核顯像：綠色熒光出現(xiàn)的位置與細(xì)胞核位置吻合。說明FITC-iCREKA能被MMP-2切開,并通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。共聚焦顯微鏡下觀察熒光在細(xì)胞內(nèi)的分布,結(jié)果顯示,細(xì)胞膜、細(xì)胞漿、核膜及核仁內(nèi)均可見高強(qiáng)度的綠色熒光分布。說明加入MMP-2后,FITC-iCREKA不僅能夠穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞漿,還能穿過核膜進(jìn)入核仁內(nèi)。(2)未加入MMP-2時(shí)與腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)：將與上述實(shí)驗(yàn)相同量的熒光探針FITC-iCREKA與U87細(xì)胞在相同條件下孵育,經(jīng)固定及DAPI染色后,置于倒置顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)U87細(xì)胞僅有輕微的綠色熒光攝取。說明未加入MMP-2時(shí),FITC-iCREKA無法穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。共聚焦顯微鏡觀察可見,細(xì)胞內(nèi)僅有極少量綠色熒光攝取。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,加入活化的MMP-2后的熒光強(qiáng)度明顯高于未加入時(shí)的熒光強(qiáng)度,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(14591.33±3099.18 vs.3328.50±910.05,t=4.774,P=0.017)。(3)對照肽FITC-CREKA與腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)：將對照肽FITC-CREKA與U87細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,無論加入活化的MMP-2還是未加入MMP-2,細(xì)胞內(nèi)均僅見極少量綠色熒光分布,提示,FITC-CREKA無穿膜能力,不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。同樣加入活化的MMP-2孵育后,實(shí)驗(yàn)組(FITC-iCREKA)的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯高于對照肽FITC-CREKA細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(14591.33±3099.18vs.3259.67±654.45,t=-6.196,P=0.003)。5.腦膠質(zhì)瘤U87腫瘤模型的建立無胸腺裸鼠皮下接種U87細(xì)胞,SPF環(huán)境下飼養(yǎng)15天左右可見局部皮膚小凸起,經(jīng)2-3周腫瘤生長至5mm～10mm用于實(shí)驗(yàn)。共接種40只,其中32只成瘤,8只無腫瘤生長,成瘤率為80%。將其中1只模型的腫瘤組織做HE染色,進(jìn)行病理組織學(xué)檢測,結(jié)果顯示符合高級別腦膠質(zhì)瘤改變。6.FITC-iCREKA在腫瘤模型體內(nèi)靶向性的驗(yàn)證為驗(yàn)證FITC-iCREKA對腫瘤間質(zhì)內(nèi)纖維蛋白的靶向性,將荷瘤鼠尾靜脈注射FITC-iCREKA后1小時(shí)分離腫瘤組織,進(jìn)行纖維蛋白原免疫熒光實(shí)驗(yàn),觀察腫瘤組織內(nèi)纖維蛋白原的分布。熒光顯微鏡下可見,腫瘤組織內(nèi)分布大量紅色熒光,呈條索狀；同時(shí)可見大量綠色熒光,且二者的分布及位置一致。說明腫瘤組織內(nèi)存在大量纖維蛋白原,且FITC-iCREKA能與腫瘤組織內(nèi)的纖維蛋白特異性結(jié)合。7.腫瘤組織內(nèi)金屬蛋白酶-2(MMP-2)免疫熒光成像為觀察腫瘤組織內(nèi)MMP-2的表達(dá)情況,將荷瘤鼠尾靜脈注射FITC-iCREKAl小時(shí)后分離腫瘤組織,做MMP-2的免疫熒光實(shí)驗(yàn)。熒光顯微鏡下,腫瘤組織內(nèi)見大量紅色熒光,與細(xì)胞核位置相吻合。說明腫瘤組織內(nèi)明顯高表達(dá)MMP-2。8.FITC-iCREKA在腫瘤組織內(nèi)的攝取及分布研究經(jīng)荷瘤鼠尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150μl)后在不同時(shí)間點(diǎn)分離腫瘤組織,制作切片在熒光顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記多肽在腫瘤內(nèi)的分布情況,結(jié)果顯示在注射后1小時(shí),FITC-iCREKA大量聚集于腫瘤間質(zhì)內(nèi),腫瘤細(xì)胞未見明顯熒光攝取。在注射后3小時(shí),腫瘤細(xì)胞內(nèi)可見明顯熒光攝取。經(jīng)荷瘤鼠尾靜脈注射對照肽FITC-CREKA后在相同時(shí)間點(diǎn)分離腫瘤組織,制作切片在熒光顯微鏡下觀察,結(jié)果顯示,熒光一直聚集于腫瘤間質(zhì),腫瘤細(xì)胞內(nèi)始終未見熒光攝取。靜脈注射FITC-iCREKA后分離荷瘤鼠腦組織行切片熒光顯像,結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常腦組織僅有少量熒光攝取,明顯低于腫瘤組織。二、膠質(zhì)瘤FITC-iCREKA熒光成像研究1. FITC-iCREKA熒光探針在荷瘤鼠體內(nèi)的生物學(xué)分布研究荷瘤鼠經(jīng)尾靜脈注射FITC-iCREKA后1小時(shí)熒光成像,結(jié)果顯示腫瘤可見明顯綠色熒光分布,明顯高于正常腦組織,為較為客觀評價(jià)FITC-iCREKA在體內(nèi)的分布情況,我們利用成像儀配制的圖像分析軟件沿臟器及組織邊緣勾畫感興趣區(qū),測定感興趣區(qū)內(nèi)的熒光攝取值,根據(jù)腫瘤/非腫瘤比值來評價(jià)探針在體內(nèi)的分布差異。本研究中,腫瘤/腦的比值為3.2±0.78,其他臟器中,雙腎及腸道可見明顯綠色熒光,腫瘤/腎、腫瘤/小腸比值低于2.0,但腫瘤與其他臟器的比值均2.0。FITC-iCREKA在荷瘤裸鼠的體內(nèi)分布與在正常裸鼠的體內(nèi)分布基本一致,均是經(jīng)肝膽和泌尿系統(tǒng)排泄,在荷瘤裸鼠體內(nèi)FITC-iCREKA在肝臟內(nèi)清除也較快,1小時(shí)成像時(shí)已基本排泄完。注射對照肽FITC-CREKA的荷瘤裸鼠分離腫瘤組織后,熒光成像結(jié)果顯示,腫瘤內(nèi)僅見少量熒光攝取,略高于腦組織,腫瘤/腦比值為1.63±0.68,明顯低于FITC-iCREKA的腫瘤/腦比值,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.2±0.78 vs.1.63±0.68,-5.067,P=0.000)。2.荷瘤鼠整體熒光斷層成像取荷膠質(zhì)瘤U87裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射FITC-iCREKA (1mM,150μl),暗室放置1小時(shí)后脫頸處死,置于-80冰箱過夜,次日將動物進(jìn)行冠狀位切層,暴露腫瘤組織后用熒光成像設(shè)備成像。從整體情況看,熒光分布與分離臟器組織后成像的分布基本一致。首先可見腫瘤呈熒光明顯攝取,熒光強(qiáng)度明顯高于正常腦組織,其他臟器心臟、雙肺、肝臟、脾臟及肌肉組織內(nèi)熒光分布均很低,但腸道熒光攝取很高,此外皮膚也呈明顯熒光攝取。該整體斷層成像亦提示FITC-iCREKA能特異性靶向腫瘤病灶,但需排除皮膚自發(fā)光的影響。三、PET分子探針18F-iCREKA的研制和PET/CT顯像研究1)18F-iCREKA的放化標(biāo)記首先制備輔助基團(tuán)18F-NFP,2-溴丙酸乙酯經(jīng)過親核氟化、KOH水解和NPC活化三步“一鍋法”反應(yīng)制得的18F-NFP,18F-NFP與多肽偶聯(lián)再經(jīng)過固相柱PlusC18分離純化,成功得到放化純度為97%的18F-iCREKA,總反應(yīng)時(shí)間為180分鐘。18F-iCREKA液體澄清、透明,經(jīng)用0.22μm微孔過濾器除菌后用于動物顯像研究。2)荷瘤鼠microPET/CT顯像研究：取腫瘤直徑在5mm-10mm的荷膠質(zhì)瘤U87裸鼠,經(jīng)尾靜脈注射顯像劑18F-iCREKA 150μCi左右,分別在注射后30分鐘、60分鐘及120分鐘行microPET/CT顯像,結(jié)果顯示,首先,在顯像的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未觀察到骨骼內(nèi)有放射性聚集,說明此顯像劑在體內(nèi)未出現(xiàn)脫氟情況,較穩(wěn)定。其次,從圖像上來看,注射顯像劑30分鐘顯像時(shí),即可見腫瘤明顯顯像,但是更多的顯像劑聚集在腹腔肝臟和腸道內(nèi),膀胱內(nèi)的放射性也很高,全身肌肉等血本底較高,腦組織未見放射性分布。60分鐘顯像時(shí),腫瘤內(nèi)放射性攝取較前升高,顯像較前清楚,周圍血本底放射性分布下降,肝臟、腸道和膀胱內(nèi)仍見大量放射性分布,腦組織內(nèi)仍未見放射性分布。120分鐘時(shí)顯像,腫瘤內(nèi)放射性攝取進(jìn)一步升高,顯像更清楚,邊界清楚,肝臟放射性下降,但可見雙腎明顯顯影,腸道和膀胱的放射性仍然很高。從各時(shí)間點(diǎn)的microPET/CT圖像看,該探針在體內(nèi)的生物學(xué)分布與熒光成像時(shí)的分布大致相同,均提示是經(jīng)肝膽系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)排泄,這對腹盆腔臟器和腫瘤的顯示造成困難。結(jié)論1.本研究成功地合成了環(huán)狀分子探針iCREKA,純度為98.27%,可滿足實(shí)驗(yàn)要求。2.成功地用FITC標(biāo)記iCREKA而制備了熒光探針FITC-iCREKA,純度達(dá)98.23%,達(dá)到體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)要求。3.體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)證明iCREKA能被MMP2在特定位點(diǎn)切開,并能進(jìn)入細(xì)胞被膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞大量攝取。4.腫瘤組織熒光成像證明FITC-iCREKA能大量聚集于腫瘤組織內(nèi),主要被腫瘤細(xì)胞攝取。5.荷瘤鼠體內(nèi)熒光生物學(xué)分布研究及整體斷層顯像顯示FITC-iCREKA能特異性靶向膠質(zhì)瘤病灶并將病灶充分“染色”,腫瘤/腦比值高。6.荷瘤鼠體內(nèi)熒光生物學(xué)分布研究顯示FITC-iCREKA主要經(jīng)肝膽系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)排泄。7.成功制備了PET分子探針18F-iCREKA,放化純度達(dá)97.0%,達(dá)到體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)要求。8.荷瘤鼠microPET/CT和PET/CT顯像證實(shí)18F-iCREKA可以特異性靶向膠質(zhì)瘤病灶,在注射后30分鐘顯像即可見腫瘤顯像,并隨時(shí)間延長,腫瘤顯像更加清楚,而周圍血本底隨時(shí)間延長而下降,具有很好的腫瘤與非腫瘤比值。荷瘤鼠體內(nèi)18F-iCREKA放射性分布與FITC-iCREKA體內(nèi)熒光分布相一致。提示18F-iCREKA可做為靶向腫瘤的PET分子探針,在腫瘤的分子顯像中具有良好的應(yīng)用潛能。
【關(guān)鍵詞】：iCREKA 膠質(zhì)瘤 分子影像 熒光成像 microPET/CT顯像
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.44
【目錄】：

• 摘要3-14
• ABSTRACT14-27
• 第一章 緒論27-46
• 1.1 前言27
• 1.2 分子影像學(xué)概述27-28
• 1.3 分子探針28-30
• 1.4 歸巢肽的研究進(jìn)展30-31
• 1.5 腫瘤間質(zhì)纖維蛋白-纖連蛋白復(fù)合物31-32
• 1.6 細(xì)胞穿膜肽的研究進(jìn)展32-34
• 1.7 基質(zhì)金屬蛋白酶34-38
• 1.8 分子影像技術(shù)38-39
• 1.9 PET/CT顯像39-44
• 1.10 本課題的研究路線44-46
• 第二章 環(huán)狀分子探針iCREKA的合成及靶向性和穿膜作用的驗(yàn)證46-76
• 2.1 前言46
• 2.2 材料與方法46-57
• 2.3 結(jié)果57-71
• 2.4 討論71-75
• 本章小結(jié)75-76
• 第三章 腫瘤模型FITC-iCREKA熒光成像研究76-85
• 3.1 前言76
• 3.2 材料與方法76-79
• 3.3 結(jié)果79-82
• 3.4 討論82-84
• 本章小結(jié)84-85
• 第四章 PET分子探針~(18)F-iCREKA的研制和PET/CT顯像研究85-95
• 4.1 前言85-86
• 4.2 材料與方法86-88
• 4.3 結(jié)果88-91
• 4.4 討論91-94
• 本章小結(jié)94-95
• 參考文獻(xiàn)95-105
• 縮略詞中英文對照表105-107
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果107-108
• 致謝108-109

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李緒斌;杜湘珂;霍天龍;劉霞;張森;;乳腺癌特異性磁共振分子探針的制備及體外實(shí)驗(yàn)[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2009年02期

2 袁洪衛(wèi);毒蕈堿乙酰膽堿受體顯像的分子探針[J];國外醫(yī)學(xué)(放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)分冊);1996年03期

3 仇文衛(wèi);湯杰;;化學(xué)小分子探針在藥物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用[J];化學(xué)教學(xué);2009年09期

4 劉杰昊;楊曉峰;王瑋;閆三華;羅俊茜;張自強(qiáng);;腫瘤靶向特異性光學(xué)分子探針的結(jié)構(gòu)與設(shè)計(jì)策略[J];中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新;2014年06期

5 劉萌;王榮福;張春麗;閆平;于明明;郭鳳琴;;脂質(zhì)體介導(dǎo)對反義分子探針腫瘤靶向作用影響的實(shí)驗(yàn)研究[J];腫瘤學(xué)雜志;2008年08期

6 鹿蓉;姚振威;;分子探針在疾病診療中的應(yīng)用與展望[J];上海醫(yī)藥;2014年13期

7 杜紹財(cái),陳蘋,劉金祥,陶其敏;生物素標(biāo)記HBVDNA分子探針臨床應(yīng)用研究[J];北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1989年05期

8 楊芳;吉民;顧寧;;以納米分子探針為基礎(chǔ)的分子影像技術(shù)在腫瘤早期檢測中的應(yīng)用[J];中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù);2009年02期

9 陳婧;江新青;;腫瘤靶向性MR分子探針的標(biāo)記及研究進(jìn)展[J];國際醫(yī)學(xué)放射學(xué)雜志;2011年06期

10 李貴平;黃寶丹;汪兵;張輝;郭琳瑯;;肺癌特異性靶向小分子多肽的核素分子探針的制備[J];放射免疫學(xué)雜志;2011年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 沈偉;劉國玉;史冠峰;路新泉;;對分子探針的認(rèn)識[A];2009中華醫(yī)學(xué)會影像技術(shù)分會第十七次全國學(xué)術(shù)大會論文集[C];2009年

2 樊蓉;韋偉;賈少微;;新型分子探針~(99)Tc~m-SQ168-TPPTS動物體內(nèi)的生物學(xué)行為[A];中華醫(yī)學(xué)會第九次全國核醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2011年

3 樊蓉;韋偉;賈少微;高宙;胡疏;胡金森;陳清;侯海峰;孫雯;;新型分子探針~(99)Tc~m-SQ168-TPPTS顯像研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第九次全國核醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2011年

4 劉鑒峰;譚建;;多模態(tài)納米分子探針的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第九次全國核醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2011年

5 王榮福;劉萌;張春麗;閆平;于明明;郭鳳琴;;脂質(zhì)體對反義寡核苷酸分子探針體內(nèi)外特異識別靶細(xì)胞組織不同影響的實(shí)驗(yàn)研究[A];首屆全國腫瘤核醫(yī)學(xué)新技術(shù)研討會論文集[C];2007年

6 葛介超;趙文文;張洪艷;汪鵬飛;;基于硅量子點(diǎn)的光學(xué)分子探針的設(shè)計(jì)及應(yīng)用研究[A];中國化學(xué)會第27屆學(xué)術(shù)年會第04分會場摘要集[C];2010年

7 唐敏;曾文彬;曹亞;;新型丹磺酰小分子探針檢測腫瘤細(xì)胞凋亡的初步研究[A];中國病理生理學(xué)會第十三屆腫瘤、第十四屆免疫專業(yè)委員會學(xué)術(shù)會議論文集[C];2012年

8 李貴平;黃寶丹;汪兵;;肺癌特異性靶向小分子多肽的核素分子探針制備[A];中華醫(yī)學(xué)會第九次全國核醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2011年

9 李奧;王志剛;趙建農(nóng);余進(jìn)洪;劉學(xué)兵;;納米級超聲分子探針的制備及其體外尋靶實(shí)驗(yàn)[A];中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第十一屆全國超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2012年

10 喬金平;葛金芳;汪琛瑋;南豆豆;周江寧;;與老年斑特異性結(jié)合的顯像分子探針[A];2011全國老年癡呆與衰老相關(guān)疾病學(xué)術(shù)會議第三屆山東省神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師（學(xué)術(shù)）論壇論文匯編[C];2011年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 麗文;用分子探針探查阿爾茨海默病[N];中國醫(yī)藥報(bào);2002年

2 衣曉峰 金鷗;分子探針為乳癌基因描繪“顯像圖”[N];中國醫(yī)藥報(bào);2013年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉沛;光學(xué)核酸分子探針信號放大策略用于生化分析的研究[D];湖南大學(xué);2014年

2 王麗娟;構(gòu)建和鑒定靶向穿膜的多功能分子探針iCREKA[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

3 田穎;~(18)F標(biāo)記預(yù)設(shè)計(jì)錨蛋白重復(fù)蛋白靶向HER2的PET顯像研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

4 孫延龍;基于活性的化學(xué)小分子探針的設(shè)計(jì)與合成及其抗腫瘤活性研究[D];中國海洋大學(xué);2011年

5 周殿明;核酸分子探針與生物傳感新方法的研究[D];湖南大學(xué);2014年

6 羅湘建;高等真菌來源化學(xué)小分子探針Grifolin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究[D];中南大學(xué);2010年

7 朱亮;以CXCR4為靶點(diǎn)的磁共振分子探針的構(gòu)建及惡性腫瘤分子靶向成像研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

8 祁世波;親和體分子探針的制備及其應(yīng)用于腫瘤影像的研究[D];天津大學(xué);2012年

9 徐健;胃癌血管生成分子探針的構(gòu)建及活體MR成像研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2013年

10 李紅陽;載HSV1-TK基因的納米超聲分子探針靶向識別并殺滅HIFU治療肝癌后殘留病灶的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 沈靜;基于MMP-2為靶點(diǎn)的腦膠質(zhì)瘤磁共振分子探針的構(gòu)建及其生物學(xué)檢測[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

2 黃海嘯;脂肪前體細(xì)胞褐色分化的小分子探針[D];南京大學(xué);2016年

3 黃偉耀;點(diǎn)擊化學(xué)~(18)氟標(biāo)記腫瘤靶向肽T7正電子分子探針合成及其初步評價(jià)[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2016年

4 吳曉鳳;RNAi技術(shù)應(yīng)用于制備診治卵巢癌的MR成像分子探針[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

5 李蒙蒙;新型生物熒光/磷光分子探針的開發(fā)與應(yīng)用[D];南陽師范學(xué)院;2015年

6 文曦琳;卵巢癌特異性分子探針的制備及初步體外實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

7 張瑜;靶向血栓MR分子探針的構(gòu)建及鑒定[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

8 雷慧;生長素型除草劑分子探針的設(shè)計(jì)合成及其生物活性研究[D];華中師范大學(xué);2014年

9 劉仍新;FITC-CSNRDARRC分子探針靶向標(biāo)記與膀胱移行細(xì)胞癌分級相關(guān)性的研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2012年

10 蘇坤;噢T飫嘌萇鋟腫猶秸氳暮銑裳芯縖D];浙江工業(yè)大學(xué);2009年

，

本文編號：813778