發(fā)布時間：2017-09-08 06:40

  本文關(guān)鍵詞：調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）在放射性肺纖維化中的作用及機制研究

  更多相關(guān)文章： Treg Th1/Th2 fibrocyte EMT β-catenin 放射性肺纖維化

【摘要】：胸部放療是治療肺癌、食道癌、乳腺癌以及多種淋巴瘤等的常用方法之一。然而由于肺組織對電離輻射具有中度敏感性,胸部放療后容易引起放射性肺炎及肺纖維化。放射性肺炎出現(xiàn)于胸部照射后早期(3個月內(nèi)),臨床癥狀為低度發(fā)燒,中度咳嗽等;隨著肺炎的進(jìn)展,可于照射后晚期(6個月后)出現(xiàn)肺纖維化的癥狀,主要特征為成纖維細(xì)胞過度增生,膠原和細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積,臨床表現(xiàn)為慢性呼吸衰竭等不可逆的癥狀,最終導(dǎo)致患者死亡。由于放射性肺纖維化的發(fā)病率較高、預(yù)測性低、治療困難,且死亡率高于原發(fā)癌癥,嚴(yán)重影響了放療的臨床應(yīng)用。因此放射性肺纖維化的治療已成為放射醫(yī)學(xué)臨床及基礎(chǔ)研究的熱點之一,其發(fā)生發(fā)展機制的研究將為預(yù)防或緩解放射性肺纖維化提供重要理論依據(jù)。我們的前期研究表明,放射性肺纖維化發(fā)生過程中肺內(nèi)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)增多,導(dǎo)致免疫平衡向Treg偏移。Treg是CD4+T細(xì)胞的亞群,具有免疫調(diào)節(jié)功能,對于維持機體免疫耐受和內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有至關(guān)重要的作用。與其他T淋巴細(xì)胞相比,Treg對電離輻射具有較高耐受性。而已有文獻(xiàn)報道Treg參與多種纖維增生性疾病的發(fā)病,因此本工作對Treg在放射性肺纖維化中的作用進(jìn)行研究,為其治療提供新的線索。成纖維細(xì)胞是肺纖維化的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞,其分泌產(chǎn)生的膠原過度沉積是纖維化發(fā)生的主要原因�，F(xiàn)有研究表明,在病理狀態(tài)下,除原發(fā)灶增殖外,骨髓來源的循環(huán)纖維細(xì)胞(circulating fibrocyte)的分化及肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelia mesenchymal transitions,EMT)也是成纖維細(xì)胞的重要來源,參與了多種纖維增生性疾病的發(fā)病。Fibrocyte是骨髓來源的前體細(xì)胞,具有分泌膠原、參與抗原提呈等重要功能。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelia mesenchymal transitions,EMT)主要包括上皮細(xì)胞極性丟失、細(xì)胞骨架重排、間質(zhì)細(xì)胞特征獲得等重要的生物學(xué)過程。有研究表明,循環(huán)纖維細(xì)胞分化及上皮細(xì)胞EMT受多種免疫因子的調(diào)控,并與免疫平衡狀態(tài)相關(guān)。而Treg是維持免疫平衡的重要因素,對循環(huán)纖維細(xì)胞分化及上皮細(xì)胞EMT具有潛在的調(diào)節(jié)作用。因此本課題旨在研究Treg在放射性肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的變化規(guī)律,闡明其對放射性肺纖維化的作用以及可能的調(diào)節(jié)機制,為防治或緩解放射IV性肺纖維化提供有效靶點和相關(guān)實驗依據(jù)。工作主要內(nèi)容如下:1.建立小鼠放射性肺纖維化模型。以C57BL/6小鼠為受試對象,采用20Gy 60Coγ射線對小鼠進(jìn)行單次全胸部照射。結(jié)果顯示,小鼠接受全胸部照射后,體重增長變緩,外周血白細(xì)胞驟減。肺組織HE染色結(jié)果顯示,照射后2周內(nèi),小鼠肺泡腔中出現(xiàn)滲出液,支氣管上皮細(xì)胞脫落;照射后1個月到6個月,肺泡結(jié)構(gòu)改變,肺泡融合及肺泡萎陷的現(xiàn)象增多,隨時間延長纖維化癥狀逐漸加重。Masson三色染色結(jié)果顯示,照射后1個月到6個月,小鼠肺間質(zhì)中纖維增生,膠原沉積,與總膠原含量測定結(jié)果相符。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示,在照射后1周內(nèi),外周血中Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例減少,在第14天時短暫升高后恢復(fù)正常水平,而肺組織中Treg從第14天到6個月內(nèi)持續(xù)升高。2.建立Treg抑制模型,觀察Treg抑制對放射性肺纖維化的作用。采用腹腔注射抗CD25抗體抑制小鼠Treg增高。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示,胸部照射小鼠注射抗CD25抗體后外周血及肺內(nèi)Treg的增高受到抑制,照后14d起肺內(nèi)Treg比例與未照射組小鼠相當(dāng)。肺組織病理切片HE染色結(jié)果顯示,Treg被抑制后,受照小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)破壞減少,肺泡融合現(xiàn)象減弱,Masson三色染色顯示肺間質(zhì)膠原分布減少,表明肺纖維化的癥狀減輕。以上結(jié)果表明,抑制Treg可減緩肺纖維化的發(fā)生,提示Treg參與促進(jìn)放射性肺纖維化的發(fā)病。3.Treg通過影響CD4+T細(xì)胞,以及Th1/Th2細(xì)胞因子之間的平衡參與放射性肺纖維化的發(fā)病。小鼠胸部照射后,流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示,肺內(nèi)CD4+T和Th17的細(xì)胞比例和數(shù)量在纖維化階段增加;當(dāng)Treg被抑制后,兩種細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步升高。細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示,小鼠受照后,肺組織中的Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-12、IL-2、IL-1α)和Th2型細(xì)胞因子(IL-10、IL-6、IL-4和IL-5)含量在纖維化階段均高于未照射組;當(dāng)Treg被抑制后,小鼠肺組織中Th1型細(xì)胞因子含量升高,Th2型細(xì)胞因子含量降低,細(xì)胞因子向Th1型極化。以上結(jié)果表明,Treg可能夠通過抑制Th17分化,擾亂Th1/Th2細(xì)胞因子之間的平衡,促進(jìn)放射性肺纖維化形成。4.Treg調(diào)節(jié)循環(huán)纖維細(xì)胞分化參與放射性肺纖維化中的發(fā)病。動物模型顯示,小鼠受照后肺組織中的循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)增加與肺纖維化增生一致,與Treg的變化趨勢吻合;當(dāng)Treg被抑制后,小鼠肺組織中的循環(huán)纖維細(xì)胞數(shù)明顯降低。趨化因子檢測結(jié)果顯示,小鼠受照后,肺組織中的趨化因子CCL2和CCL3含量明顯升高,與循環(huán)纖維細(xì)胞變化趨勢一致;當(dāng)Treg被抑制后,小鼠肺組織中CCL2及CCL3含量降低,但仍高于未照射組。以上結(jié)果表明,Treg可能通過促進(jìn)循環(huán)纖維細(xì)胞在肺部的聚集而加速放射性肺纖維化,而循環(huán)纖維細(xì)胞聚集由趨化因子CCL2及CCL3介導(dǎo)。采用分離的小鼠脾臟Treg和單個核細(xì)胞建立共培養(yǎng)體系。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,培養(yǎng)14天后,Treg與單個核細(xì)胞共培養(yǎng)體系中纖維細(xì)胞的比例增高,并與Treg比例具有劑量效應(yīng)關(guān)系,表明Treg能促進(jìn)循環(huán)纖維細(xì)胞的分化。細(xì)胞因子檢測結(jié)果顯示,共培養(yǎng)細(xì)胞上清中CCL2和CCL3趨化因子含量高于Treg或單個核細(xì)胞單獨培養(yǎng)條件下的含量。以上結(jié)果證明了Treg可能通過CCL2、CCL3促進(jìn)循環(huán)纖維細(xì)胞在肺部的聚集和形成,是其參與放射性肺纖維化的機制之一。5.Treg通過β-連環(huán)蛋白調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞EMT參與對放射性肺纖維化中的發(fā)病。在動物實驗中,免疫熒光的結(jié)果顯示,在小鼠肺纖維化階段,肺泡上皮細(xì)胞中的間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-鈣粘素(N-cadherin)表達(dá)增加,并隨照后時間的延長,上皮細(xì)胞標(biāo)志物的細(xì)胞表面蛋白C(Pro-surfactan protein C,SPC)逐漸丟失,提示放射性肺纖維化發(fā)病過程中EMT增強;抑制Treg后,小鼠肺組織上皮細(xì)胞N-cadherin表達(dá)減弱,SPC丟失減輕,表明EMT減弱。免疫組化結(jié)果顯示,EMT重要信號通路蛋白β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在肺組織上皮細(xì)胞胞漿和胞核中表達(dá)增加;而抑制Treg后,β-catenin表達(dá)降低,提示Treg可能通過β-catenin調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞EMT參與對放射性肺纖維化中的發(fā)病。建立體外輻射誘導(dǎo)EMT的細(xì)胞體系,以及小鼠肺上皮細(xì)胞系(MLE12)經(jīng)照射后與原代分離的小鼠脾臟Treg細(xì)胞共同培養(yǎng)的體系。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示,其EMT發(fā)生率為13.2%,顯著高于照射后的MLE12單獨培養(yǎng)(9.3%,p0.05)。Western blot結(jié)果顯示,在共培養(yǎng)條件下,MLE12中β-catenin的表達(dá)高于MLE12單獨培養(yǎng)情況。采用RNAi下調(diào)MLE12細(xì)胞β-catenin的表達(dá),結(jié)果表明,與未干涉細(xì)胞相比,下調(diào)β-catenin后Treg誘導(dǎo)MLE12發(fā)生EMT的比例下降(14.3%vs 16.2%,p0.05)。上述結(jié)果提示β-catenin介導(dǎo)的EMT的發(fā)生是Treg調(diào)節(jié)放射性肺纖維化發(fā)生發(fā)展的另一機制。綜上所述,我們成功建立了放射性肺纖維化模型,證明了Treg參與放射性肺纖維化發(fā)展的過程,驗證了Treg通過抑制Th17分化、擾亂Th1/Th2型細(xì)胞因子平衡、通過趨化因子CCL2、CCL3增加纖維細(xì)胞在肺部的聚集及分化、促進(jìn)β-catenin介導(dǎo)的EMT的發(fā)生,從而促進(jìn)放射性肺纖維化的形成。本課題的研究成果為利用抑制Treg的措施緩解并治療放射性肺纖維化提供了重要參考。
【關(guān)鍵詞】：Treg Th1/Th2 fibrocyte EMT β-catenin 放射性肺纖維化
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730.55
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-15
• 前言15-19
• 第一章Treg對放射性肺纖維化的作用19-41
• 第一節(jié) 建立小鼠放射性肺纖維化模型19-27
• 1 實驗材料和方法19-21
• 2 實驗結(jié)果21-24
• 3 小結(jié)與討論24-27
• 第二節(jié) 抑制Treg對放射性肺纖維化的影響27-41
• 1 實驗材料和方法27-31
• 2 實驗結(jié)果31-38
• 3 小結(jié)與討論38-41
• 第二章Treg在放射性肺纖維化中的作用機制研究41-97
• 第一節(jié)Treg對放射性肺纖維化中CD4+T細(xì)胞及其重要亞群的影響41-59
• 1 實驗材料方法41-46
• 2 實驗結(jié)果46-56
• 3 小結(jié)與討論56-59
• 第二節(jié)Treg對放射性肺纖維化中fibrocyte的作用及機制研究59-75
• 1 實驗材料和方法59-67
• 2 實驗結(jié)果67-72
• 3 小結(jié)與討論72-75
• 第三節(jié)Treg對放射性肺纖維化中上皮細(xì)胞EMT的影響75-97
• 1 實驗材料和方法75-83
• 2 實驗結(jié)果83-94
• 3 小結(jié)與討論94-97
• 結(jié)論97-99
• 參考文獻(xiàn)99-111
• 附錄111-119
• 綜述119-129
• 參考文獻(xiàn)124-129
• 致謝129-131
• 個人簡歷131-13

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳永鳳,劉巨源,許彩青,暴秀梅;肺纖維化大鼠肺組織鈣含量及鈣調(diào)素活性的研究[J];天津醫(yī)藥;2002年09期

2 陳曉玲,李英敏,黃善生,王殿華,李文斌;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶對肺纖維化形成的促進(jìn)作用[J];中國病理生理雜志;2002年10期

3 崔曉聰,鄭桂鳳;藥物致剝脫性皮炎型藥疹并肺纖維化1例報告[J];華北煤炭醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2002年03期

4 劉濤,宋良文;肺纖維化發(fā)生的分子機制和早期防治研究進(jìn)展[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2003年04期

5 王金勝,曾慶富;肺纖維化的分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J];中華結(jié)核和呼吸雜志;2004年06期

6 張吉平;甘紅英;;轉(zhuǎn)化生長因子β_1及其受體在類風(fēng)濕性肺纖維化中的作用[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2004年08期

7 婁克儉;肺纖維化發(fā)病機制的研究進(jìn)展(綜述)[J];中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生;2005年04期

8 宮麗],任進(jìn);腎素-血管緊張素系統(tǒng)對肺纖維化形成的調(diào)節(jié)[J];中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2005年05期

9 翟秀軍,宋道遠(yuǎn);老年肺纖維化臨床分析[J];中國老年學(xué)雜志;2005年09期

10 賈充惠;急性重度毒鼠強中毒致肺纖維化一例[J];中國呼吸與危重監(jiān)護雜志;2005年06期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 楊s，

本文編號：812480