研究背景糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥,發(fā)病率高,當(dāng)發(fā)展至終末期腎病階段可造成患者死亡,目前尚無(wú)有效的治愈方法。因此,對(duì)糖尿病腎病進(jìn)行早期干預(yù)以延緩病情進(jìn)展,改善患者生活質(zhì)量顯得尤為重要。近年來(lái)細(xì)胞移植治療糖尿病及其并發(fā)癥已成為發(fā)展方向和研究熱點(diǎn)。研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可修復(fù)胰腺,減輕腎損傷、加速腎小管增殖、促進(jìn)腎功能的恢復(fù)。然而在干細(xì)胞治療過(guò)程中,由于經(jīng)靜脈移植的MSC在DN腎臟中檢出率很低,細(xì)胞難以到達(dá)病變組織,嚴(yán)重阻礙MSC對(duì)損傷腎臟的修復(fù)作用,因此迫切需要提高移植干細(xì)胞的腎向歸巢能力�；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1(Stromal cell-derived factor-1,SDF-1)和它的特異性受體CXCR4構(gòu)成的SDF-1/CXCR4軸是MSC歸巢過(guò)程中最重要的分子通路。SDF-1能夠強(qiáng)力誘導(dǎo)干細(xì)胞遷移歸巢到損傷組織,具有抑制MSC的凋亡、增加MSC的存活率及增殖活性等作用。當(dāng)組織損傷時(shí),SDF-1在受損組織中的表達(dá)水平提高。文獻(xiàn)報(bào)道,糖尿病患者的外周血中SDF-1/CXCR4水平降低,合并多器官損傷時(shí)下降更明顯,可見(jiàn)SDF-1/CXCR4軸在糖尿病以及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用,因此,提高糖尿病腎病腎臟的SDF-1水平有望提高M(jìn)SC的歸巢能力。超聲造影劑(微泡)可作為基因、蛋白質(zhì)及藥物的載體,在超聲介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)藥物靶向傳輸和基因轉(zhuǎn)染。超聲靶向擊破微泡(Ultrasound-targeted microbubble destruction,UTMD)技術(shù)可以提高腎間質(zhì)的通透性,改變腎臟的微環(huán)境,促使局部細(xì)胞因子分泌,有利于MSC在靶組織的“著床”。本研究設(shè)想將SDF-1與微泡共價(jià)連接,經(jīng)靜脈注射進(jìn)入循環(huán),通過(guò)超聲輻照靶向釋放至腎臟,提高腎臟SDF-1的濃度,同時(shí)利用超聲聯(lián)合微泡產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)改變腎臟微環(huán)境,促進(jìn)靜脈移植的外源性干細(xì)胞歸巢至糖尿病腎病腎臟,達(dá)到改善MSC治療效果的目的。探索該方法提高糖尿病腎病的MSC歸巢效率、修復(fù)腎臟損傷的可行性,期望為增強(qiáng)糖尿病腎病的干細(xì)胞治療效果提供一個(gè)新的視角。研究目的1.探討微泡攜載趨化因子SDF-1的可行性,評(píng)價(jià)載SDF-1微泡的理化性質(zhì)、體內(nèi)外生物學(xué)活性及超聲顯影能力。2.探討診斷超聲聯(lián)合微泡對(duì)大鼠腎臟血管通透性的影響及安全性,觀察超聲聯(lián)合載SDF-1微泡在腎臟靶向釋放SDF-1,提高腎臟SDF-1濃度的可行性及有效性。3.對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)并標(biāo)記,用于體內(nèi)移植示蹤;建立大鼠早期1型糖尿病腎病模型,用于模仿人類疾病的發(fā)展及治療。4.探討診斷超聲聯(lián)合載SDF-1微泡促進(jìn)靜脈移植MSC歸巢至糖尿病腎病腎臟的可行性。5.探討診斷超聲靶向釋放SDF-1聯(lián)合靜脈移植MSC修復(fù)大鼠糖尿病腎病的可行性及有效性,為糖尿病腎病的治療提供一種新的策略方法。研究方法1.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取、培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。并通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞周期,透射電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu),綜合判斷其生物學(xué)特性。用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞的表面標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞成脂及成骨分化判斷其多向分化潛能。分別用綠色熒光蛋白慢病毒轉(zhuǎn)染、CM-Di I染色、DAPI染色的方法對(duì)干細(xì)胞胞漿、胞膜及胞核進(jìn)行標(biāo)記,比較三種標(biāo)記效果后選定合適的方法用于體內(nèi)示蹤。2.用碳二亞胺激活羧基的方法,將SDF-1與含有雙端羧基官能團(tuán)的聚乙二醇(COOH-PEG4000-COOH)共價(jià)連接,制備載SDF-1脂質(zhì)微泡。通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察微泡的形態(tài)、分布,顆粒計(jì)數(shù)器檢測(cè)微泡的粒徑及濃度。用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記SDF-1,制備載FITC標(biāo)記SDF-1微泡。激光共聚焦顯微鏡下觀察FITC標(biāo)記的SDF-1與微泡的結(jié)合情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SDF-1的攜帶率。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)載SDF-1微泡中SDF-1的攜載量及包封率,免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)SDF-1與PEG結(jié)合后的分子量變化。超聲觀察微泡在體外以及在腎臟的增強(qiáng)顯影能力。將載SDF-1微泡溶解后,用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖能力的影響,用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其趨化干細(xì)胞的生物學(xué)活性。3.診斷超聲聯(lián)合微泡作用于大鼠左側(cè)腎臟,以右側(cè)未輻照腎臟作為對(duì)照,用透射電子顯微鏡觀察大鼠腎臟血管超微結(jié)構(gòu)改變,結(jié)合硝酸鑭灌注法觀察腎臟通透性的改變及其恢復(fù)情況。激光共聚焦顯微鏡觀察超聲靶向擊破微泡技術(shù)在左側(cè)腎臟靶向釋放FITC標(biāo)記SDF-1的效果。4.單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)法建立大鼠早期1型糖尿病腎病模型,檢測(cè)模型大鼠的血糖,尿糖,用HE染色、過(guò)碘酸雪夫染色(PAS)及免疫組織化學(xué)染色觀察胰腺、左腎的病理組織學(xué)變化及左腎SDF-1表達(dá)情況。將健康大鼠及模型大鼠分為對(duì)照組(Control),超聲靶向擊破微泡組(UTMD),超聲靶向擊破載SDF-1微泡組(UTMD+SDF-1),對(duì)左側(cè)腎臟進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn),用ELISA、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及Western blot比較各分組腎臟SDF-1水平的差異。將體外標(biāo)記好的MSC經(jīng)靜脈移植入大鼠體內(nèi),激光共聚焦顯微鏡觀察示蹤24 h后MSC在各組左側(cè)腎臟中的歸巢數(shù)量。5.超聲擊破微泡靶向釋放SDF-1聯(lián)合經(jīng)靜脈移植MSC,觀察該方法修復(fù)大鼠糖尿病腎病的效果。分為正常對(duì)照組(Normal),糖尿病腎病組(DN),糖尿病腎病+干細(xì)胞移植組(DN+MSC),糖尿病腎病+超聲釋放SDF-1組(DN+SDF-1),糖尿病腎病+超聲釋放SDF-1+干細(xì)胞移植組(DN+SDF-1+MSC),比較實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)后4周、12周的治療效果。監(jiān)測(cè)大鼠血糖,檢測(cè)24h尿白蛋白及尿肌酐,計(jì)算尿白蛋白/尿肌酐比值(ACR),評(píng)價(jià)腎功能。超聲觀察左側(cè)腎臟大小、形態(tài)、實(shí)質(zhì)回聲、血流灌注及動(dòng)脈血流阻力指數(shù)。HE染色觀察胰腺病理變化。PAS及免疫組織化學(xué)觀察左側(cè)腎臟病理改變及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)的表達(dá)變化。結(jié)果1.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法成功提取大鼠骨髓源性MSC,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD29和CD90陽(yáng)性,CD34、CD45和CD11b陰性。細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)培養(yǎng)的MSC具有成脂、成骨分化潛能。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示其具有旺盛的增殖能力,細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示大部分細(xì)胞處于G0+G1期,比例約83.00%。形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞具有未分化細(xì)胞的特征。細(xì)胞可被GFP慢病毒轉(zhuǎn)染,在胞漿及胞核表達(dá)強(qiáng)烈的綠色熒光,并可傳代表達(dá);可被CM-Di I標(biāo)記,在細(xì)胞膜發(fā)出紅色熒光;可被DAPI標(biāo)記,在細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色熒光。2.采用共價(jià)連接的方法成功制備得到載SDF-1脂質(zhì)微泡。光學(xué)顯微鏡下載SDF-1微泡與普通微泡形態(tài)相似,為表面光滑規(guī)整的圓球形,經(jīng)PBS稀釋后分散良好,分布均勻。粒徑檢測(cè)結(jié)果顯示,普通微泡粒徑范圍1.5~5mm,平均粒徑約1.78mm,微泡濃度約5~9×109/m L;載SDF-1微泡粒徑范圍1.5~5mm,平均粒徑1.92mm,微泡濃度約2~6×109/m L。SDF-1的包封率為79%,攜載量為15.8mg/m L,攜帶率84.4%。激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)FITC標(biāo)記的SDF-1微泡表面呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示SDF-1(分子量約8 k D)與雙端羧基PEG(分子量4 k D)結(jié)合后分子量發(fā)生變化,出現(xiàn)三個(gè)不同分子量的條帶,分子量分別為8 k D、12 k D及20 k D。低機(jī)械指數(shù)超聲造影模式下,普通微泡與載SDF-1微泡均能產(chǎn)生強(qiáng)烈的聲學(xué)信號(hào),成像能力出色,微泡在大鼠腎臟微血管充盈良好,有良好的增強(qiáng)顯影能力。CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)超聲溶解后的微泡溶液對(duì)體外培養(yǎng)的干細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)載SDF-1微泡溶液具有與SDF-1相似的趨化MSC遷移的能力,AMD3100能抑制該趨化作用,證實(shí)其保留有趨化干細(xì)胞的生物學(xué)活性。3.診斷超聲聯(lián)合微泡作用于大鼠左側(cè)腎臟,超微結(jié)構(gòu)顯示血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性中斷,細(xì)胞間緊密連接開放,血管通透性增加,硝酸鑭示蹤劑漏出至血管外的間質(zhì)中,24h后通透性可恢復(fù)正常。激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)FITC標(biāo)記SDF-1被成功地靶向釋放至左側(cè)腎臟。4.單次腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)后3天,大鼠血糖持續(xù)在16.7 mmol/L以上,大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿,體重減少等典型的糖尿病癥狀,證明糖尿病模型成功建立。4周后,尿微量白蛋白排泄率大于30 mg/24 h,初步判定早期糖尿病腎病模型成功建立。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示腎臟SDF-1呈弱表達(dá),而正常腎臟幾乎不表達(dá)。ELISA結(jié)果顯示DN組腎臟SDF-1濃度高于健康大鼠(1010.44±88.53 pg/m L VS 208.03±42.34pg/m L,P0.05)。UTMD后即刻DN與健康大鼠腎臟SDF-1濃度無(wú)明顯升高,6 h后分別升高至(1257.68±103.88)pg/m L及(401.78±50.13)pg/m L,UTMD+SDF-1后即刻DN與健康大鼠左腎SDF-1濃度顯著上升,分別達(dá)到(1750.08±131.36)pg/m L和(760.97±91.85)pg/m L,6 h后濃度繼續(xù)升高達(dá)(2120.23±159.75)pg/m L和(953.89±79.33)pg/m L,與未處理組及UTMD組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。PCR結(jié)果顯示UTMD及UTMD+SDF-1后即刻,健康大鼠與DN大鼠SDF-1的m RNA表達(dá)均無(wú)明顯提高,而6 h后表達(dá)均有顯著增高(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示健康大鼠左腎SDF-1表達(dá)極少,UTMD后即刻SDF-1表達(dá)無(wú)變化,6 h后略有增加,UTMD+SDF-1后即刻表達(dá)增加(P0.05),6 h后增加更明顯。DN大鼠左腎SDF-1弱表達(dá),UTMD后即刻表達(dá)無(wú)變化,6 h后略有增加,UTMD+SDF-1后即刻蛋白含量增加(P0.05),6 h后SDF-1增加最明顯,與各組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。分組實(shí)驗(yàn)后移植GFP標(biāo)記的MSC,24 h后MSC在DN大鼠UTMD+SDF-1組腎臟發(fā)現(xiàn)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量達(dá)(23.8±3.61)個(gè),遠(yuǎn)高于DN組的(3.6±2.07)個(gè)(P0.05)。5.血糖監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,未進(jìn)行干預(yù)的糖尿病大鼠血糖呈進(jìn)行性升高,由(22.93±6.51)mmol/L上升至DN成模12周的(30.25±4.78)mmol/L,與DN+SDF-1組表現(xiàn)相似。移植MSC后,無(wú)論是否靶向釋放SDF-1,血糖濃度均下降,第2周降至最低水平后維持在22 mmol/L左右,但均未能回歸至正常水平的(4.67±1.04)mmol/L。尿樣生化檢測(cè)結(jié)果顯示,DN組及DN+SDF-1組的ACR值隨時(shí)間逐漸上升,至12周時(shí)分別為(660.32±70.21)mg/mg和(620.39±50.83)mg/mg,高于相同時(shí)間點(diǎn)的正常大鼠115~126mg/mg。DN+MSC組和DN+SDF-1+MSC組的ACR值明顯降低,至12周時(shí)分別為(350.23±54.47)mg/mg和(278.23±51.34)mg/mg。DN+SDF-1+MSC組的ACR水平低于DN+MSC組(P0.05)。超聲檢查發(fā)現(xiàn),糖尿病腎病大鼠4周內(nèi)實(shí)質(zhì)回聲及彩色血流均無(wú)明顯變化,至12周時(shí)實(shí)質(zhì)回聲增強(qiáng),血流灌注減少,動(dòng)脈阻力指數(shù)升高達(dá)0.71±0.16。DN+SDF-1組無(wú)明顯改善。DN+MSC組12周時(shí)左腎實(shí)質(zhì)回聲略增強(qiáng),血流灌注有所改善,RI降至0.63±0.12。DN+SDF-1+MSC組左腎實(shí)質(zhì)回聲及血流灌注改善更明顯,RI降至0.60±0.14。病理檢查發(fā)現(xiàn),腹腔注射STZ后,大鼠胰腺內(nèi)的胰島結(jié)構(gòu)數(shù)量逐漸減少,體積逐漸減小,腎臟細(xì)胞外基質(zhì)的面積出現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì),12周后胰島結(jié)構(gòu)少見(jiàn),體積小而形態(tài)多樣,細(xì)胞排列極為紊亂,失去正常的胰島結(jié)構(gòu)。腎臟出現(xiàn)腎小球硬化、系膜增生、基底膜增厚的表現(xiàn)。DN+SDF-1組胰島、左腎病理組織形態(tài)學(xué)無(wú)明顯改善。DN+MSC組及DN+SDF-1+MSC組胰島病理組織學(xué)有所改善,左腎損傷程度明顯弱于DN組及DN+SDF-1組,雖然不能逆轉(zhuǎn)病變進(jìn)展,但亦未出現(xiàn)進(jìn)行性加重的現(xiàn)象。腎組織致纖維化因子TGF-β1免疫組化染色后發(fā)現(xiàn),正常腎組織TGF-β1呈弱表達(dá),DN與DN+SDF-1組左腎表達(dá)增加,并隨病情加重持續(xù)增加。DN+MSC組與DN+SDF-1+MSC組4周后左腎TGF-β1表達(dá)無(wú)明顯增加,12周后均有增加趨勢(shì),但均明顯弱于同時(shí)間點(diǎn)的DN組及DN+SDF-1組,DN+SDF-1+MSC組抑制左腎TGF-β1表達(dá)的效果優(yōu)于DN+MSC組。結(jié)論1.通過(guò)全骨髓貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法成功提取、培養(yǎng)大鼠骨髓源性MSC,獲得的細(xì)胞具有低分化、高自我更新能力、多向分化潛能的特點(diǎn),可分別用GFP慢病毒轉(zhuǎn)染、CM-Di I標(biāo)記及DAPI標(biāo)記在細(xì)胞漿、細(xì)胞膜及細(xì)胞核上標(biāo)記熒光。2.通過(guò)共價(jià)結(jié)合成功制備載SDF-1微泡,其粒徑符合體內(nèi)注射要求,穩(wěn)定性好,濃度高,SDF-1的攜載量及攜帶率均較高。載SDF-1微泡在體內(nèi)及體外均具有良好的超聲顯影能力,對(duì)體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞無(wú)明顯的毒副作用,同時(shí)保留趨化干細(xì)胞的生物學(xué)活性。3.腹腔單次注射STZ(60mg/Kg)4周后可建立穩(wěn)定的大鼠早期1型糖尿病腎病模型。4.超聲靶向微泡擊破技術(shù)可以提高腎組織通透性,并且具有可恢復(fù)性。5.超聲擊破載SDF-1微泡可將SDF-1靶向釋放至腎組織,通過(guò)提高靶區(qū)組織的SDF-1濃度,改變腎臟微環(huán)境及增加血管通透性,可以促進(jìn)移植的外源性干細(xì)胞的腎向歸巢能力,6小時(shí)內(nèi)是移植MSC的適宜時(shí)機(jī)。6.移植MSC可以修復(fù)糖尿病大鼠受損的胰島,降低血糖,改善糖尿病腎病大鼠腎臟功能,降低TGF-β1的表達(dá),抑制腎小球、腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展。7.超聲擊破載SDF-1微泡提高SDF-1濃度,通過(guò)增加外源性MSC的腎向歸巢效果,更有效地延緩糖尿病腎病的進(jìn)展,對(duì)腎臟的修復(fù)作用優(yōu)于單純的MSC移植。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R445.1;R587.2
【文章目錄】：
縮略語(yǔ)表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
第二章 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及標(biāo)記
    2.1 材料與方法
    2.2 結(jié)果
    2.3 討論
    2.4 小結(jié)
第三章 載SDF-1 微泡的制備、表征及體外生物學(xué)活性研究
    3.1 材料與方法
    3.2 結(jié)果
    3.3 討論
    3.4 小結(jié)
第四章 超聲聯(lián)合載SDF-1 微泡促M(fèi)SC在早期糖尿病腎病大鼠中的腎向歸巢
    4.1 材料與方法
    4.2 結(jié)果
    4.3 討論
    4.4 小結(jié)
第五章 超聲擊破載SDF-1 微泡聯(lián)合靜脈移植MSC對(duì)大鼠早期糖尿病腎病的修復(fù)效應(yīng)
    5.1 材料與方法
    5.2 結(jié)果
    5.3 討論
    5.4 小結(jié)
全文總結(jié)
創(chuàng)新點(diǎn)和新穎性
不足之處和研究展望
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述 超聲微泡造影劑在靶向治療中的應(yīng)用研究
    參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間的研究成果
致謝

【參考文獻(xiàn)】

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