【摘要】：細胞凋亡是生物體一種調(diào)節(jié)細胞群體相對恒定的重要方式，近年已成為生命科學中一個非常熱門的研究熱點。細胞凋亡早期的特征是磷脂酰絲氨酸基團(PS)的外翻，能與PS高度特異性結(jié)合的Annexin V成為了研究早期細胞凋亡的重要標識物。近年在分子核醫(yī)學顯像研究中，用放射性核素標記Annexin V的凋亡顯像劑研究也取得了很大的進步，這對提高對疾病的認識、評價指導疾病的治療以及新藥的開發(fā)等都具有重要的意義。 本論文研究的主要目的是在已有的文獻基礎(chǔ)上，利用國內(nèi)基因工程技術(shù)制備的重組的人Annexin V進行放射性核素的標記和評價，希望制備出可用于臨床細胞凋亡研究的顯像劑。本論文的主要研究內(nèi)容如下： 1、重組Annexin V的制備純化 研究了工程菌的誘導表達和蛋白質(zhì)的純化。建立了Annexin V工程菌誘導表達的最佳溫度、時間和包涵體的操作程序，并通過離子層析純化后得到了高純度的Annexin V。 2、~(131/125)I-Annexin V的制備研究研究了~(131/125)I-Annexin V的標記條件和穩(wěn)定性，建立了紙色層和高壓液相的分析方法。采用Iodo-Gen標記法，反應10min后，~(131/125)I-Annexin V的標記率大于80％，經(jīng)PD-10純化后，其放化純大于95％。標記物在室溫下穩(wěn)定性較好。ITLC-SG薄層分析，展開體系為正丁醇/乙醇/氨水(5/1/2)，Rf：標記物=0.0-0.1，Γ=0.5-0.7，碘酸=0.7-0.9。HPLC：GF250色層柱，流動相為0.01mmol/LPBS，流速為1.0ml/min，保留時間：標記物為6.3min，游離碘為9.7min。3、~(99m)Tc-HYNIC-Annexin V的制備研究研究了雙功能偶聯(lián)劑的S-HYNIC的合成、偶聯(lián)劑與Annexin V的連接和~(99m)Tc-HYNIC-Annexin V的標記以及純化，建立了薄層分析和高壓液相的分析方法。(1)合成的S-HYNIC經(jīng)元素分析、IR、~1H-NMR、快原子質(zhì)譜確證為所預期的化合物。解決了合成中關(guān)鍵的第三和第四步中3個難點：除去DMF、無水和去BOC問題。(2)偶聯(lián)條件：1mol Annexin V(5.5mg/mL)與6mol S-HYNIC在HEPES溶液中避光反應5h，每個Annexin V連接上2個HYNIC，比文獻值 中國原子能科學研究院博士學位論文 高一倍。首次研究了緩沖溶液對偶聯(lián)的影響。(3)通過“3+1”的二元混合配 體絡合的方案，以Tricine作為協(xié)同試劑，氯化亞錫作為還原劑，室溫反應30min 后，制備得放化純95%的”9’”幾一H翎xe一Annexinv。標記物t匕活度為26.sMBq 恤gAnnexinV，比文獻值要高2倍以上。 4、生物學評價和動物實驗 研究了”’‘’2’I一Annexinv、”9nl介一H州le一Annexinv的體內(nèi)外生物學性質(zhì)和動 物實驗。(l)”51一Annexinv能在體外檢測細胞的凋亡，與FITc一Annexinv流 式細胞分析的結(jié)果能較好的吻合。首次初步建立了’2，I一Annexinv體外細胞凋 亡的放射配基結(jié)合分析的基礎(chǔ)。(2)通過細胞結(jié)合分析定量測定了Annexinv 的生物活性，Ko=8.53士3.3OnmolzL，盯一8.79士2.2Inmol/L。(3)正常小鼠體內(nèi)分 布表明:’2行一Annexinv主要濃聚于肝、脾、腎，在體內(nèi)易脫碘:”gmTc- HYNIC一AnnexinV主要濃聚于肝、脾、腎和肺，從腎臟排泄。(4)通過sn大 鼠凋亡模型的分布和顯像實驗:確定了環(huán)磷酞胺誘導骨髓內(nèi)細胞的凋亡(主 要在脾臟和股骨等臟器)的最佳時間為72h:首次確定了’3’I一Annexinv的最 佳凋亡顯像時間為6h，”glllTc一HYNIc一Annexinv為3h。(5)環(huán)磷酞胺誘導凋亡 的動態(tài)顯像結(jié)果表明，注射”gmTc一HYNIc一Annexinv后，實驗組與對照組的 股骨的放射性濃聚比值隨時間的增加而增加，在lh后增加的速率放慢，3h達 到最大。驗證了3h為”gmTc一HYNIc一Allnexinv的最佳凋亡顯像時間。 總之，本論文是首次利用國內(nèi)制備的重組人AnnexinV進行放射性核素的 標記和評價，其中用’2，I一Annexinv進行體外細胞凋亡的放射配基結(jié)合分析，以 及確定”’l一Annexinv和”gm幾一H洲Ie一Annexinv的最佳凋亡顯像時間的實驗， 還未見有文獻報道�，F(xiàn)有的實驗結(jié)果表明:’2，I一Armexinv能在體外檢測細胞的 凋亡;制備的’3’‘’2，I一Annexinv和”9，，，幾一H州Ie一Annexinv可以有效檢測鼠類體 內(nèi)的細胞凋亡，特別是”gmTc一HYNIc一Annexinv將會成為臨床上一種很有前景的 體內(nèi)細胞凋亡顯像劑。
【學位授予單位】：中國原子能科學研究院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R817
【圖文】：

圖1一3、凋亡細胞常用檢測方法的原理1.3細胞凋亡的常用檢測技術(shù)研究細胞凋亡的方法與技術(shù)很多(圖1一3)，人們研究出了許多種體外檢測凋亡的方法，如:(l)電鏡形態(tài)學觀察，是確定凋亡最經(jīng)典、最可靠的方法，但不能定量;(2)DNA凝膠電泳，依據(jù)“階梯狀，，(ladder)條帶來確定凋亡，方法簡便，但只能半定量，且靈敏性較差，要求所測標本的細胞數(shù)在10“以上;(3)酶聯(lián)免疫吸附(ELlsA)測定核小體法，靈敏性高，可檢測凋亡細胞數(shù)達5xl護mL一’

AnnexinV是一種鈣離子依賴性并能與膜磷脂結(jié)合的附加蛋白質(zhì)，具有抗凝血用，它的分布廣泛，在多種組織細胞(如心肌細胞、血管內(nèi)皮、骨骼肌、肝細胞等)表達。Anne勸nV是人體內(nèi)原本就存有的一種蛋白質(zhì)，分子量約為36KD，最是由胎盤分離出來【’2，”】。人們從80年代開始就對Annexinv的功能和結(jié)構(gòu)進了多方位的研究198，99，’00，’�！俊０说秐e對nv共由319個氨基酸殘基組成，并確定了應的coNA[’02]。由于天然來源的Annexinv含量低，無法批量提供。在進行Annexinv的基因程中，因為AnnexinV蛋白5’編碼區(qū)GC含量高，所以很難直接在E.coli中獲得ne勸nV的高表達。為此，采用表達融合蛋白的方法，在Arme勸nV前加上一噬菌體的蛋白質(zhì)MsZ聚合酶片段(大約15KD)，再在其間引入凝血酶識別序列。樣表達蛋白經(jīng)凝血酶消化，去除MSZ蛋白質(zhì)后，經(jīng)層析即可獲得高純度非融合AnnexinVI‘03]。DNA的克隆的基本過程見圖2一1。

(1:30℃sh;2:30oCgh;3:42oClh;4;42oCZh;5:42oC4h;6:包涵體;7:純化后的蛋白)3.2包涵體和蛋白質(zhì)的純化包涵體經(jīng)過提取洗滌以及凝血酶切后，通過SDS.PAGE分析(見圖2一3中6)含有大量的AnnexinV。重組蛋白質(zhì)Anne勸nV經(jīng)過層析純化后得到約4OmL的蛋白溶液。通過SDS一PAGE分析(見圖2一3中7)得到高純度的重組蛋白質(zhì)AnnexinVOAnne五nV的分子量與文獻值一致[59，69]。3.3蛋白質(zhì)的含量測定BCA的標準曲線見圖2并，擬合后的標準曲線為Y=習.06476+0.oo119x(r=0.997l4)。3個平行樣為OD562=1.77，171，1.86，平均為1.78，從而A陰exinV的濃度為1.44mg/mLO同樣的蛋白溶液測得OD280nln二1.800，OD260nln=l.760。帶入經(jīng)驗公式得蛋白濃度:1.55xoD280一0.76又OD260氣.45(mg/mL)。兩種方法的結(jié)果能較好的吻合

【引證文獻】

相關(guān)碩士學位論文 前2條

1 羅聯(lián)哲;生長抑素類似物～（99m）Tc-EDDA/HYNIC-Lys～0-TOCA的制備及其糖基化衍生物合成方法研究[D];中國原子能科學研究院;2006年

2 賈兵;～（99m）Tc及～（90）Y標記抗胃癌單克隆抗體3H11的研究[D];中國原子能科學研究院;2006年

本文編號：2755991