【摘要】：乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,目前主要采取手術(shù)結(jié)合放／化療的綜合治療手段進(jìn)行治療,但是乳腺癌的高度異質(zhì)性使得部分分子亞型尤其是三陰性乳腺癌的療效欠佳,預(yù)后較差,是近年來(lái)乳腺癌診治研究的難點(diǎn)和關(guān)注的焦點(diǎn),而且輻射抵抗仍是三陰性乳腺癌放射治療面臨的重要難題。許多研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常高表達(dá)和AKT異�；罨谌橄侔┯绕涫侨幮匀橄侔┲袕V泛存在,與其輻射抵抗和預(yù)后不良密切相關(guān),而且Wnt/β-catenin信號(hào)通路異�；罨@著提高了乳腺癌細(xì)胞對(duì)輻射誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂(DSBs)的修復(fù)能力。為此,本研究選用具有靶向抑制乳腺癌細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路作用的氯硝柳胺,從細(xì)胞分子水平首次證實(shí)氯硝柳胺對(duì)人三陰性乳腺癌細(xì)胞具有顯著的放射增敏作用,抑制輻射誘導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化和AKT激活,同時(shí)抑制輻射誘導(dǎo)DNA DSBs的非同源末端連接(non-homologous end joining. NHEJ)修復(fù)通路是其放射增敏的重要機(jī)制。本研究以期探尋新的針對(duì)三陰性乳腺癌的靶向放射增敏劑,并為氯硝柳胺與放療聯(lián)合應(yīng)用以提高治療三陰性乳腺癌的療效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第一部分：氯硝柳胺對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞的放射增敏作用與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路和AKT活性的作用機(jī)制目的 研究世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦殺滅絳蟲(chóng)的首選藥物氯硝柳胺對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞的放射增敏作用及其抑制輻射誘導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化和AKT激活的作用機(jī)制。方法 四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)不同濃度氯硝柳胺對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞及非三陰性乳腺癌T-47D和MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,以及不同濃度的LiCl對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,求得IC50值。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、氯硝柳胺或LiCl單純給藥組、單純照射組、氯硝柳胺+照射組或LiCl聯(lián)合氯硝柳胺+照射組,氯硝柳胺和LiCl預(yù)處理各種細(xì)胞的的濃度均為低于各自20%IC50,克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)氯硝柳胺和LiCl聯(lián)合氯硝柳胺作用對(duì)乳腺癌細(xì)胞放射敏感性的影響,137Cs y射線的照射劑量為0、2、4和6 Gy;免疫熒光法檢測(cè)輻射誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞P-catenin核內(nèi)定位情況；Western blot法檢測(cè)p-β-catenin和β-catenin、p-AKT和AKT、Cyclin D1以及cleaved-caspase-3、 caspase-3、Bax、Bcl-2和LC-3β蛋白的表達(dá);流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果MDA-MB-231、Hs578T、T-47D和MCF-7細(xì)胞的SF6值分別為0.17±0.05、0.12±0.02、0.06±0.01和0.03±0.01,表明三陰性乳腺癌細(xì)胞較非三陰性乳腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的輻射抗性。氯硝柳胺抑制MDA-MB-231、Hs578T、T-47D和MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)24 h的ICso值分別為13.63±0.43、25.32±0.54、3.87±0.11和3.68±0.13μM,LiCl抑制MDA-MB-231生長(zhǎng)24 h的IC50值為154.11±2.86mM。1.0和1.5μM氯硝柳胺預(yù)處理MDA-MB-231細(xì)胞后的SER值分別為1.40±0.06和1.63±0.07,1.0和1.2州氯硝柳胺預(yù)處理Hs578T細(xì)胞后的SER值分別為1.54±0.06和1.63±0.06,0.4和0.8μM氯硝柳胺預(yù)處理T-47D、MCF-7細(xì)胞后的SER值分別為0.96±0.04、0.99±0.03、1.12±0.06和1.18±0.10。10mM LiCl和1.5μM氯硝柳胺聯(lián)合預(yù)處理MDA-MB-231細(xì)胞后的SER值為1.24±0.09。氯硝柳胺預(yù)處理顯著抑制了輻射誘導(dǎo)的MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞代表入核的p-β-catenin (S675)、β-catenin、Cyclin D1、p-AKT (S473)和p-AKT (T308)蛋白表達(dá)的升高,并明顯降低輻射誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞β-catenin在核內(nèi)的積聚(P0.05),顯著提高輻射誘導(dǎo)的cleaved-caspase-3和LC-3p蛋白表達(dá),致使輻射誘導(dǎo)G2/M期阻滯明顯減少(P0.05)、細(xì)胞凋亡顯著增加(P0.05)。LiCl消除了氯硝柳胺下調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞p-β-catenin(S675)、β-catenin及Cyclin D1表達(dá)的作用,從而消除了氯硝柳胺引起的G0/G1期阻滯。結(jié)論氯硝柳胺對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231和Hs578T細(xì)胞具有顯著的放射增敏作用,而對(duì)雌、孕激素受體陽(yáng)性的T-47D和MCF-7細(xì)胞的放射敏感性無(wú)明顯影響,提示氯硝柳胺的放射增敏作用可能對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞具有特異性。其作用機(jī)制與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路和AKT活性,減少輻射誘導(dǎo)的G2/M期阻滯,顯著增加caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)細(xì)胞自噬有關(guān)。Wnt/p-catenin信號(hào)通路可能是放射增敏三陰性乳腺癌的重要通路。第二部分：氯硝柳胺對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞的放射增敏作用與抑制DNA雙鏈斷裂修復(fù)的作用機(jī)制目的探討氯硝柳胺對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的放射增敏作用與DSBs修復(fù)能力之間的關(guān)系。方法將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、氯硝柳胺單純給藥組、單純照射組和氯硝柳胺+照射組,氯硝柳胺預(yù)處理的濃度為1.5μM,137Csγ射線的照射劑量為6 Gy;免疫熒光法檢測(cè)輻射誘導(dǎo)的γH2AX、p-DNA-PKcs(T2609)、Rad51 foci形成,Western blotting法檢測(cè)53BP1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 1.5μM氯硝柳胺預(yù)處理使輻射誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的γH2AX foci產(chǎn)額較單純照射組顯著增加(P0.05),并且能夠顯著抑制輻射引起的53BP1蛋白表達(dá)水平的上調(diào)(P0.01)和p-DNA-PKcs(T2609) foci升高(P0.05),對(duì)Rad51foci形成無(wú)顯著影響。結(jié)論氯硝柳胺能夠顯著提高輻射誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的DNA DSBs產(chǎn)額、抑制非同源末端連接修復(fù)通路而發(fā)揮其放射增敏作用,而對(duì)同源重組修復(fù)通路無(wú)明顯影響。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R737.9;R730.55
【圖文】：

圖１邋Ｗｎｔ／ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ經(jīng)典途徑\″義媳礱鰨祝睿簦ǎ常悖幔簦澹睿硇藕磐凡喚鏨婕暗較窒俜⒂母鞲黿錐�，员都参与了乳腺癌的发生侯^⒄構(gòu)�，并灾R橄侔┑腦ず籩蟹⒓易寮捌淶鞍自諶橄俜⒂牟煌逼誄氏侄澩锏謀浠�，影我更新和扩杂z郟保擔(dān)藎殼胺⑾衷趕僦兄遼儆校噸鄭祝睿艋蟣戇┗潁祝睿簦焓牽保梗福材暄芯咳嗽痹諦∈筧橄儆柿鮒惺狀畏

本文編號(hào)：2755851