發(fā)布時(shí)間：2020-07-01 17:16

【摘要】：目的：確定碳離子輻照引起的線粒體DNA損傷和突變情況；探討利用硅碳量子點(diǎn)標(biāo)記線粒體的可能性；初步研究線粒體活性氧激發(fā)劑的生物學(xué)效應(yīng)。 材料和方法：采用12C6+離子束或X射線對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行輻照，熒光定量PCR進(jìn)行線粒體DNA5464-7287編碼區(qū)損傷和4977大片段缺失定量檢測(cè)；輻照后克隆存活檢測(cè)；直接測(cè)序法檢測(cè)D310區(qū)點(diǎn)突變。細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)硅碳量子點(diǎn)（SiCDs）的細(xì)胞毒性，酶標(biāo)儀檢測(cè)硅碳量子點(diǎn)處理后細(xì)胞和斑馬魚體內(nèi)SOD、MDA和ROS的含量，激光共聚焦確定其染色部位。MTT實(shí)驗(yàn)和酶標(biāo)儀檢測(cè)光誘導(dǎo)型線粒體活性氧激發(fā)劑Mitochondros的發(fā)光特性及細(xì)胞毒性。 結(jié)果：線粒體DNA5464-7287編碼區(qū)對(duì)0.5-2Gy碳離子輻射有很高的敏感性，預(yù)先半小時(shí)加入維生素C后的樣本線粒體DNA損傷明顯減少。以10%存活分?jǐn)?shù)（D10）作為標(biāo)準(zhǔn)，碳離子對(duì)MCF-7細(xì)胞的相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)為3.1（1.5Gy碳離子/4.65Gy X射線）。D310區(qū)SNP位點(diǎn)克隆突變檢測(cè)發(fā)現(xiàn)碳離子輻照后存活的MCF-7細(xì)胞中正常C7序列比X射線輻照后明顯減少（58%vs.74%），單堿基插入C8和單堿基缺失C6的豐度則明顯升高，分別是18%和24%。碳離子和X射線輻照后MCF-7細(xì)胞中線粒體DNA4977缺失的變化趨勢(shì)在72小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)一致，照后24小時(shí)達(dá)到峰值，并在隨后的48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)迅速下降至本底水平。射線類型對(duì)線粒體DNA4977缺失的產(chǎn)生無(wú)明顯區(qū)別。生物相容性檢測(cè)顯示低濃度SiCDs對(duì)24h細(xì)胞和斑馬魚存活無(wú)影響，其染色后細(xì)胞和斑馬魚的SOD及MDA含量降低。SiCDs的染色性質(zhì)測(cè)定表明SiCDs在活細(xì)胞及活體成像中熒光信號(hào)強(qiáng)，耐光性好，且在405、488和555nm均可檢測(cè)到熒光信號(hào)，SiCDs對(duì)HepG2的染色沒(méi)有進(jìn)入細(xì)胞核,只有胞質(zhì)區(qū)表現(xiàn)出熒光。中低濃度的線粒體活性氧激發(fā)劑Mitochondros培養(yǎng)24h對(duì)HepG2細(xì)胞存活無(wú)影響，其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)在428nm和600nm，培養(yǎng)24h后細(xì)胞中Mitochondros的熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)除最低濃度0.1ng/ml外，其他濃度的Mitochondros熒光強(qiáng)度與0.1ug/ml的最高熒光強(qiáng)度值無(wú)明顯區(qū)別。 結(jié)論：碳離子輻照會(huì)引起嚴(yán)重的線粒體DNA5464-7287編碼區(qū)損傷，損傷主要來(lái)源于氧化脅迫。碳離子對(duì)MCF-7細(xì)胞的殺傷作用明顯強(qiáng)于X射線，且其對(duì)于D310區(qū)的致突變能力顯著高于X射線輻照。線粒體DNA4977bp缺失的存在對(duì)宿主細(xì)胞能夠產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化脅迫，在大多數(shù)情況下不能在存活細(xì)胞中得到遺傳，且碳離子與X射線所引起的線粒體DNA大片段缺失突變沒(méi)有本質(zhì)區(qū)別。低濃度SiCDs對(duì)細(xì)胞和斑馬魚沒(méi)有毒性，熒光信號(hào)強(qiáng)，耐光性好，適合作為生物學(xué)熒光標(biāo)識(shí)物，其線粒體靶向性有待提高。中低濃度線粒體活性氧激發(fā)劑Mitochondros培養(yǎng)24h對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，線粒體內(nèi)能容納的Mitochondros的量是一定的，初步說(shuō)明其適合作為細(xì)胞中的活性氧激發(fā)劑。結(jié)合之前的MTT實(shí)驗(yàn)，最高熒光強(qiáng)度值的濃度0.1ug/ml可以作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)濃度。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院研究生院（近代物理研究所）
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：Q691;R730.55
【圖文】：

量碳重離子或 X 射線處理后 MCF-7 細(xì)胞的存活曲線 D310 區(qū)點(diǎn)突變檢測(cè)SNP 位點(diǎn)克隆突變檢測(cè)發(fā)現(xiàn) X 射線能夠在存活細(xì)胞中引變，重離子射線輻照后存活的 MCF-7 細(xì)胞中正常 C7 序），單堿基插入C8和單堿基缺失C6的豐度則明顯升高， 2.1。這表明重離子射線輻照在 MCF-7 細(xì)胞中能夠引起嚴(yán)1 在兩組處理?xiàng)l件下存活細(xì)胞克隆中 D310 多態(tài)性分布情D310 C-track Sham-irradiated X-ray Carbon ionsC6 8% 16% 24%C6/C7 4% 0 0C7 74% 70% 58%C8 12% 14% 18%C7/C8 2% 0 0

MCF-7細(xì)胞經(jīng)1.5 Gy 碳重離子或4.65 Gy X射線輻照后72小時(shí)以內(nèi)線977缺失含量變化情況論6+離子束輻照可以引起線粒體 DNA5464-7287 區(qū)的損傷。線粒體既是氧的主要來(lái)源又是活性氧攻擊的主要靶點(diǎn)，維生素 C 作為一種被廣泛化劑，對(duì)輻照導(dǎo)致的線粒體 DNA 損傷有顯著的保護(hù)作用。維生素 C 給電子而轉(zhuǎn)變成脫氫抗壞血酸，以清除·OH、DPPH·等自由基。低劑射后細(xì)胞內(nèi)線粒體 DNA 損傷的主要來(lái)源是自由基，此時(shí)，只有有效來(lái)源活性氧才能線粒體 DNA 損傷。極低劑量（0.5Gy）重離子輻照時(shí) 數(shù)量增加可能由于線粒體 DNA 是環(huán)狀結(jié)構(gòu)，極低劑量輻照僅僅破壞初的完整結(jié)構(gòu)使其變?yōu)榫�性，從而提高了擴(kuò)增效率，導(dǎo)致線粒

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2737056