【摘要】：慢性胰腺炎(Chronic Pancreatitis, CP)是指由于各種不同病因引起胰腺組織和功能的持續(xù)性損害,其病理特征為胰腺纖維化。隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變,CP發(fā)病率不斷升高。由于CP病程遷延,最終可導(dǎo)致胰管擴(kuò)張、胰管結(jié)石或鈣化等不可逆的形態(tài)改變,引起反復(fù)腹痛及內(nèi)、外分泌功能降低所致的脂肪瀉、糖尿病等,大多數(shù)預(yù)后不佳,部分病人死于并發(fā)癥或發(fā)展為胰腺癌。及早發(fā)現(xiàn)CP征像、準(zhǔn)確監(jiān)測其結(jié)構(gòu)或功能變化,對指導(dǎo)治療、改善患者的預(yù)后具有重要意義。 影像學(xué)檢查是診斷CP的重要手段,目前臨床常用的影像技術(shù)對具有胰腺萎縮、鈣化、胰管結(jié)石、胰管擴(kuò)張、假性囊腫形成等明顯形態(tài)學(xué)改變的中重度CP,大多能做出準(zhǔn)確的診斷,但對形態(tài)學(xué)改變輕微的早期CP,則很難做出明確診斷。作為分子影像學(xué)和代謝組學(xué)重要手段的磁共振波譜分析技術(shù)(Magnetic Resonance Spectroscopy, MRS)在CP診斷中的應(yīng)用近年來逐漸受到人們的關(guān)注,MRS檢測被廣泛應(yīng)用于腫瘤、癲癇、冠心病、感染等疾病的研究,體外研究方法包括液體(如血液、尿液、唾液、乳液、腦脊液、胰液等)高分辨MRS、生物組織塊的高分辨魔角旋轉(zhuǎn)氫質(zhì)子核磁共振波譜(High-resolution Magic Angle Spinning1H Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, HR MAS1H NMR)研究。目前臨床使用的磁共振儀可以直接對活體胰腺病變組織進(jìn)行波譜分析,但由于磁場強(qiáng)度過低,空間分辨率低,獲得的代謝物信息少并有誤差,診斷價值有限。體外測試的高分辨MRS具有高靈敏度和高分辨率的特性,樣品的前處理簡單,因此可較方便的應(yīng)用于慢性胰腺炎的代謝研究。在胰腺疾病應(yīng)用方面已報道的研究主要包括血液、胰液的磁共振波譜分析和生物組織塊的高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振波譜研究。 磁共振擴(kuò)散加權(quán)成像(Diffusion Weighted Imaging, DWI)是反映活體組織中水分子含量和擴(kuò)散運(yùn)動狀態(tài)的功能成像技術(shù)。由于CP組織纖維化并伴有血流灌注減少和分泌功能降低,致使CP組織的表觀彌散系數(shù)(Apparent Diffusion Coefficient, ADC值)與正常胰腺及胰腺癌不同；新近有學(xué)者報道ADC值對有癥狀CP病人的診斷和判斷CP嚴(yán)重程度有幫助。作為一種無創(chuàng)傷無輻射的檢查方法,磁共振胰膽管成像Magnetic Resonance Cholangiopancreatography (MRCP)能夠清晰顯示胰膽管的形態(tài)表現(xiàn),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于胰膽管疾病的影像學(xué)診斷,但因其對細(xì)小分支胰管等細(xì)節(jié)的顯示劣于ERCP,不能敏感反映早期CP胰管改變,胰泌素刺激磁共振胰膽管成像(secretin-enhanced magnetic resonance cholangio-pancreatography, S-MRCP)在CP的早期診斷和外分泌功能改變定量檢測方面的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注,用胰泌素追蹤胰管形態(tài)變化和胰腺功能評估可能有助于提高分支胰管異常改變的顯示率,從而有助于CP的早期診斷。 本研究通過大部結(jié)扎主胰管的方法制作小型豬阻塞性慢性胰腺炎模型,行磁共振MRCP、S-MRCP及DWI成像,以及離體胰腺組織塊及血液尿液的高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振質(zhì)子波譜分析,用病理作為金標(biāo)準(zhǔn),研究上述方法在評估CP嚴(yán)重程度,尤其是發(fā)現(xiàn)早期CP的價值。 第一部分阻塞性慢性胰腺炎小型豬模型的建立及CT觀察 目的：建立適合進(jìn)行影像學(xué)研究的慢性胰腺炎(chronic pancreatitis, CP)大動物模型 材料和方法：將39頭小型豬隨機(jī)分為實驗組和對照組,實驗組27頭,對照組12頭,對實驗組小豬經(jīng)剖腹進(jìn)行主胰管大部結(jié)扎,從而建立阻塞性慢性胰腺炎模型,對照組為假手術(shù)組,僅僅開腹后翻動胰腺及腸道。在造模后第4、8、12周,實驗組和對照組分別隨機(jī)抽取1/3小型豬(實驗組9頭,對照組4頭)行動態(tài)CT增強(qiáng)檢查,然后處死獲取胰腺大體標(biāo)本后進(jìn)行大體及鏡下病理觀察(HE染色及VG染色),以胰腺腺泡萎縮、纖維化程度及炎細(xì)胞浸潤進(jìn)行慢性胰腺炎的分級,并觀察病理分期與時間之間的關(guān)系。 結(jié)果：12頭對照組小豬全部完成了試驗流程,27頭實驗組小豬中有3頭死亡,死亡原因分別為術(shù)中麻醉意外、胰瘺致腹腔感染(術(shù)后第2周)及胸腹腔感染心包積液(術(shù)后第5周),其他24頭小豬完成了試驗。病理檢查表明對照組12頭小豬全部為正常(0期),實驗組24頭小豬病理分期分別為：0期(正常)2頭,Ⅰ期(輕度慢性胰腺炎)10頭,Ⅱ期(中度)5頭,Ⅲ期(重度)7頭。CP嚴(yán)重程度與主胰管結(jié)扎時間增加而增加(r=0.997,P=0.034)。動態(tài)CT增強(qiáng)掃描檢查表明,隨著CP程度加重,實驗豬胰腺實質(zhì)CT強(qiáng)化值逐漸降低,且達(dá)峰時間延長,在注射對比劑后第30s和35s兩個時間點,正常胰腺CT強(qiáng)化峰值最高,重度CP組最低,且各期CP之間強(qiáng)化CT峰值有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論：采用主胰管大部結(jié)扎法建立小型豬阻塞性慢性胰腺炎模型的成功率高,CP纖維化程度與梗阻時間呈正相關(guān),隨著CP程度加重,實驗組強(qiáng)化CT值達(dá)峰時間延長且峰值降低。 第二部分阻塞性慢性胰腺炎模型的功能性磁共振表現(xiàn)及其與病理的對照研究 目的：探討實驗性阻塞性慢性胰腺炎(CP)胰泌素增強(qiáng)動態(tài)胰膽管成像(S-MRCP)及磁共振彌散加權(quán)成像(DWI)的表現(xiàn)及其與病理嚴(yán)重程度的相關(guān)性。 材料與方法：39頭巴馬小型豬隨機(jī)分成兩組,實驗組27頭,正常對照組12頭；實驗組采用主胰管不全結(jié)扎法建立CP模型,對照組開腹僅翻動胰腺及腸道。在造模術(shù)后4、8、12周,每組隨機(jī)抽取1/3實驗動物(實驗組9頭,對照組4頭)行S-MRCP掃描。方案為先進(jìn)行DWI掃描并測量正常及各期CP胰腺ADC值,然后進(jìn)行MRCP(胰泌素給藥前,0min)及靜推胰泌素后1、3、5、7、9、11min動態(tài)S-MRCP掃描,觀測主胰管直徑、十二指腸液充盈程度的變化。處死動物,解剖胰腺行大體病理學(xué)及鏡下觀察(HE和VG染色),將影像表現(xiàn)與病理對照。 結(jié)果：(1)本實驗?zāi)Ｐ徒⒊晒Σ@得清晰S-MRCP圖像情況：正常對照組11頭,輕度CP組8頭,中重度CP組11頭。(2)主胰管各項指標(biāo)檢測結(jié)果：三組主胰管直徑胰泌素刺激前后動態(tài)變化總體趨勢比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=49.003,P=1.3*10-11)。胰泌素刺激前,胰管基礎(chǔ)直徑比較,正常組、輕度CP組和中重度CP組主胰管基礎(chǔ)直徑分別為1.56±0.46mm,2.95±1.170mm,7.41±1.91mm,正常組和輕度CP,輕度和中重度CP主胰管直徑差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034,1.0*10-7,均0.05)。胰泌素刺激后主胰管最大徑比較,正常組(2.39±0.43mm)與輕度CP組(3.63±1.25mm)主胰管最大徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.056,0.05),而輕度CP組明顯小于中重度CP(7.86±1.87mm)(P=2.4*10-7,0.05)。胰管擴(kuò)張達(dá)峰時間比較,正常組胰管擴(kuò)張達(dá)峰時間(3.00±0.00min)和輕度CP組(2.75±0.71min)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.386,0.05),而輕度CP組則早于中重度CP組(3.36±0.81min)(P值為0.039,0.05)。胰管最大變化率比較,三組胰管最大變化率分別為59.84±34.76%,33.1±14.23,6.92±4.41%。正常組胰管最大變化率明顯大于輕度和中重度CP(P=0.0024.3*10-6,均小于0.05),輕度組大于中重度CP組(P=0.009,0.05)。(3)十二指腸充盈程度評估結(jié)果。胰泌素給藥11min后,正常組十二指腸充盈程度與輕度CP組差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.7440.05),而輕度CP十二指腸充盈程度分級明顯低于與中重度CP (P=0.001,0.05)。隨著CP進(jìn)展,實驗豬胰腺ADC值逐漸降低,但正常胰腺與輕度CP之間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異,輕度與中重度CP胰腺之間有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論：S-MRCP可用于在體、無創(chuàng)的評估胰腺腺泡外分泌功能和導(dǎo)管的排泌功能狀態(tài),尤其是主胰管最大擴(kuò)張率可以用于早期發(fā)現(xiàn)輕度CP,并且有助于判斷CP病理的嚴(yán)重程度。DWI掃描ADC值在CP早期診斷方面無特殊意義,但如果CP診斷明確,ADC值可以幫助判斷CP的病理嚴(yán)重程度。 第三部分阻塞性慢性胰腺炎模型胰腺組織塊高分辨魔角旋轉(zhuǎn)氫質(zhì)子磁共振波譜分析 目的：利用高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振波譜分析(HR-MAS NMR)方法探索早期阻塞性慢性胰腺炎的代謝特征。 材料和方法：39頭巴馬小型豬隨機(jī)分成實驗組(n=27)和對照組(n=12)；實驗組采用主胰管不全結(jié)扎法建立慢性胰腺炎模型,對照組為假手術(shù)組。在造模術(shù)后4、8、12周,每組隨機(jī)抽取1/3實驗動物(實驗組9頭,對照組4頭)行相關(guān)影像學(xué)檢查后處死獲取胰腺組織,并行大體病理學(xué)及鏡下觀察(HE和VG染色),將所獲取組織塊分為正常胰腺組,輕、中及中度慢性胰腺炎組,并對胰腺組織塊進(jìn)行HR-MAS NMR分析其代謝特征,利用主成分分析法篩選特異性代謝標(biāo)志物,并對各組胰腺組織的特異性代謝物特征進(jìn)行比較分析。 結(jié)果：27頭實驗組豬中,術(shù)中及術(shù)后共有3頭小豬死亡(1頭為麻醉意外,另2頭死于感染),剩余24頭實驗小豬中共有22頭被病理確定形成慢性胰腺炎(剩余2頭為正常胰腺),其中輕度10頭,中度5頭,重度7頭,對照組12頭小豬全部為正常胰腺。HR-MAS NMR及主成分分析結(jié)果表明在慢性胰腺炎病程中,膽堿、甘氨酸、甜菜堿、乳酸、脂肪酸、磷酸膽堿／甘油磷酸膽堿8種代謝物為特征性的代謝產(chǎn)物。隨著炎癥進(jìn)展,甘氨酸、甜菜堿、磷酸膽堿／甘油磷酸膽堿、亮氨酸／異亮氨酸／結(jié)氨酸水平整體趨勢是逐漸下降的,但正常組與輕度組、中度組與重度組間無統(tǒng)計學(xué)差異,其他各組間均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)；乳酸水平整體趨勢逐漸升高,但正常組與輕度慢性胰腺炎組、中度組與重度組間無統(tǒng)計學(xué)差異,其他各組間均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)；膽堿、�；撬崴皆谳p度時一過性升高,但在中重度時又下降,但輕度CP組膽堿水平與其他各組水平均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),而各組間�；撬崴骄鶡o統(tǒng)計學(xué)差異；四組中輕度組的脂肪酸水平最低,且與重度組脂肪酸水平有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),其他各組間均無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論：早期慢性胰腺炎主要是炎癥反應(yīng)對胰腺組織細(xì)胞的破壞,胰腺自身代謝處于代償期,膽堿可能作為早期診斷慢性胰腺炎的生化標(biāo)志物；隨著炎癥進(jìn)展,胰腺代謝逐漸失代償,相關(guān)代謝標(biāo)志物(膽堿,甜菜堿、磷酸膽堿／甘油磷酸膽堿、亮氨酸／異亮氨酸／結(jié)氨酸、甘氨酸和乳酸)呈現(xiàn)趨勢性改變,并與病理改變有良好相關(guān)性。 第四部分小型豬慢性胰腺炎模型的血清及尿液代謝組學(xué)研究 目的：對不同程度慢性胰腺炎(CP)小豬的血清及尿液,采用超高效液相色譜(UHPLC)與四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(Q-TOF/MS)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)分析,初步篩選正常及各期CP小豬血清及尿液的代謝組學(xué)特征,尋找能夠有助于CP早期診斷的可能生化標(biāo)志物。 材料和方法：采用主胰管大部結(jié)扎法制作小型豬慢性胰腺炎模型39頭,對照組為12頭小型豬假手術(shù)組,并在造模術(shù)后4、8、12周,每組隨機(jī)抽取1/3實驗動物(實驗組9頭,對照組4頭)行相關(guān)影像學(xué)檢查后處死獲取胰腺組織及血液尿液標(biāo)本,最后經(jīng)胰腺病理結(jié)果分為對照組、輕度CP組及中重度CP組,血清及尿液標(biāo)本經(jīng)過預(yù)處理后,行超高效液相色譜(UHPLC)與四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(Q-TOF/MS)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行代謝組學(xué)分析,分析后獲得總離子色譜(total ion chromatography, TIC)。對獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行整合并進(jìn)行多元統(tǒng)計分析(multivariate analysis,MVA),包括偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),正交信號校正偏最小二乘法分析(orthogonal single collection partial least squares,OPLS)后分別獲得得分圖(scores plot)和負(fù)載圖(loading plot)以及可能的生化標(biāo)志物。 結(jié)果：基于UHPLC-TOF-MS譜圖信息,使用PLS-DA模型對三組血清樣本分析表明,對照組、輕度CP組及中重度CP組均有較明顯的分離趨勢,通過OPLS發(fā)現(xiàn)三組間可能相關(guān)的生化標(biāo)志物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)逐漸上調(diào)的標(biāo)志物有3種,逐漸下調(diào)的有2種,輕度CP組下調(diào)而中重度CP組上調(diào)的有5種；尿液樣本分析結(jié)果表明對照組與各期CP組均有顯著差異,而輕度CP組與中重度CP組間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異,對照組與輕度CP組相比較,正負(fù)模式下共發(fā)現(xiàn)22種模型組標(biāo)志物,其中6種上調(diào),16種下調(diào)。上述代謝標(biāo)志物均通過與代謝小分子數(shù)據(jù)庫(http://metlin.scripps.edu)確認(rèn)。 結(jié)論：應(yīng)用基于UHPLC-TOF-MS的代謝組學(xué)方法可了解CP模型豬的尿液及血清代謝變化規(guī)律,采用相關(guān)代謝標(biāo)志物及其變化規(guī)律有助于CP的早期診斷。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R576;R445.2

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