本文選題：TIGAR + TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)��； 參考：《蘇州大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：目的：干擾TP53誘導(dǎo)的糖酵解及凋亡調(diào)節(jié)蛋白（TIGAR）表達(dá)可以增加人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性，但其機(jī)制尚不明了。硫氧還原蛋白-1（TRX1）是一個(gè)通過核轉(zhuǎn)運(yùn)參與電離輻射后DNA損傷修復(fù)過程的重要的還原蛋白。由于TRX1依賴NADPH保持還原狀態(tài)從而發(fā)揮功能，而在氧化應(yīng)激條件下，增加TIGAR表達(dá)有助于產(chǎn)生更多的NADPH從而幫助細(xì)胞對(duì)抗氧化。本課題試圖通過改變TIGAR的表達(dá)水平，研究TIGAR對(duì)TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及其在調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性中的作用，從而闡述TIGAR調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制；通過比較TIGAR在膠質(zhì)瘤細(xì)胞與正常膠質(zhì)細(xì)胞中功能的差異，探討TIGAR作為膠質(zhì)瘤放療增敏靶點(diǎn)的可能性；最后，通過建立人腦膠質(zhì)瘤裸鼠原位種植模型，驗(yàn)證TIGAR調(diào)節(jié)細(xì)胞放射敏感性的機(jī)制。達(dá)到闡明干擾TIGAR表達(dá)增加人腦膠質(zhì)瘤放射敏感性機(jī)制的目的。 方法：采用Western blot技術(shù)檢測(cè)電離輻射對(duì)細(xì)胞TIGAR表達(dá)水平及p53蛋白水平的影響；通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)電離輻射后細(xì)胞TIGAR、TP53轉(zhuǎn)錄水平的改變；通過轉(zhuǎn)染TIGAR siRNA干擾TIGAR表達(dá)，構(gòu)建pcDNA3.1-TIGAR瞬時(shí)過表達(dá)TIGAR；采用流式細(xì)胞技術(shù)、NADPH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)電離輻射前后細(xì)胞的氧化還原水平；通過轉(zhuǎn)染野生型TRX1過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-WT-TRX1）及突變型TRX1過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-MT-TRX1）、G418篩選得到野生型及突變型TRX1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞株；采用克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)電離輻射后細(xì)胞的克隆存活率；通過免疫熒光技術(shù)評(píng)價(jià)電離輻射后不同時(shí)間點(diǎn)（0.5-12h）膠質(zhì)瘤細(xì)胞DNA損傷的修復(fù)水平；通過Western blot技術(shù)檢測(cè)干擾TIGAR表達(dá)對(duì)細(xì)胞TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)的影響；采用氧化還原Western blot技術(shù)檢測(cè)電離輻射前后TRX1蛋白的氧化還原水平。最后通過原位種植膠質(zhì)瘤細(xì)胞建立人腦膠質(zhì)瘤裸鼠原位種植模型；通過原位注射TIGAR shRNA慢病毒實(shí)現(xiàn)基因治療，并采用核磁共振成像（MRI）技術(shù)評(píng)價(jià)基因治療聯(lián)合放療的治療效果。 結(jié)果：（1）電離輻射后，p53野生型人腦膠質(zhì)瘤A172細(xì)胞內(nèi)TIGAR表達(dá)水平在照后1h開始增加，照后8h回落至基礎(chǔ)水平；p53蛋白水平于照后0.5h開始增加，先于TIGAR表達(dá)增加。而在受照的p53突變型（M237I）T98G細(xì)胞中，，TIGAR與p53蛋白水平均無顯著增加�？寺⌒纬稍囼�(yàn)顯示，干擾TIGAR表達(dá)顯著降低受照A172、T98G細(xì)胞克隆存活率。（2）干擾TIGAR表達(dá)顯著增加受照膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）水平并造成受照細(xì)胞內(nèi)NADPH水平耗竭，在單純照射組細(xì)胞內(nèi)NADPH的含量?jī)H較照射前下降了40%，而TIGAR干擾聯(lián)合照射組細(xì)胞內(nèi)NADPH的含量較照射前下降了約75%。相似的，干擾TIGAR表達(dá)也引起了受照膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG比例的進(jìn)一步下降，而TIGAR過表達(dá)則可顯著增加受照膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的NADPH含量與GSH/GSSG的比例。Western blot結(jié)果顯示，電離輻射后細(xì)胞內(nèi)TRX1可發(fā)生核轉(zhuǎn)運(yùn)，核轉(zhuǎn)運(yùn)的峰值時(shí)間為照后2h。而干擾TIGAR表達(dá)可顯著抑制受照膠質(zhì)瘤A172、T98G細(xì)胞內(nèi)的TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)。（3）干擾TIGAR表達(dá)無法抑制野生型TRX1過表達(dá)A172細(xì)胞發(fā)生電離輻射誘導(dǎo)的TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)。氧化還原Western blot結(jié)果表明A172細(xì)胞受照后，胞漿內(nèi)TRX1于照后0.5h內(nèi)被氧化，于照后8h回復(fù)到還原狀態(tài)，而干擾TIGAR表達(dá)可顯著延緩細(xì)胞漿內(nèi)TRX1的還原進(jìn)程，結(jié)果顯示胞漿內(nèi)TRX1于照后8h仍處于氧化狀態(tài)。而在野生型TRX1過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)，TIGAR干擾無法延緩TRX1的還原進(jìn)程，電離輻射后細(xì)胞核內(nèi)TRX1的氧化還原進(jìn)程與細(xì)胞漿內(nèi)TRX1類似，也可被干擾TIGAR表達(dá)延緩�？寺⌒纬稍囼�(yàn)的結(jié)果顯示，野生型TRX1過表達(dá)可顯著抑制TIGAR干擾引起的放射增敏效應(yīng)，而突變型TRX1過表達(dá)聯(lián)合TIGAR干擾無法在單純干擾TIGAR表達(dá)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步減少受照膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆存活率。更為關(guān)鍵的是，增加TIGAR表達(dá)對(duì)TRX1突變型細(xì)胞的放射敏感性無顯著影響，表明TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)在TIGAR調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性中發(fā)揮了重要作用。（4）免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，受照A172γ-H2AX的點(diǎn)狀熒光在照后4h內(nèi)消失，而在TIGAR干擾組A172細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX點(diǎn)狀熒光直到照后12h依然存在，表明細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)進(jìn)程被顯著延遲。與Western blot的結(jié)果相似，免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示受照A172細(xì)胞內(nèi)TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)的峰值時(shí)間為照后2h，而TIGAR干擾組細(xì)胞內(nèi)TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)則完全消失。在野生型TRX1過表達(dá)細(xì)胞中，干擾TIGAR表達(dá)導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù)延遲與TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制均得到了顯著恢復(fù)。（5）與膠質(zhì)瘤細(xì)胞不同，改變TIGAR表達(dá)無法改變正常腦膠質(zhì)細(xì)胞的放射敏感性。并且盡管電離輻射后，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可以觀察到TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象，但干擾TIGAR表達(dá)無法抑制電離輻射引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)，也無法延緩受照星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TRX1的還原進(jìn)程。氧化還原Western blot的結(jié)果還顯示，受照星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TRX1的氧化程度顯著低于相同照射條件下腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)TRX1的氧化還原程度。（6）通過TIGARshRNA慢病毒基因治療，證實(shí)了干擾TIGAR表達(dá)可增加荷瘤小鼠顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的放療敏感性。 結(jié)論：本課題的研究首次提出在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)干擾TIGAR表達(dá)顯著抑制電離輻射引起的TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)，此現(xiàn)象很可能與干擾TIGAR表達(dá)的放射增敏機(jī)制有關(guān)。干擾TIGAR表達(dá)抑制TRX1核轉(zhuǎn)運(yùn)的原因可能與破壞細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)、導(dǎo)致受照細(xì)胞內(nèi)TRX1過氧化及還原進(jìn)程延緩有關(guān)。干擾TIGAR表達(dá)無法抑制野生型TRX1過表達(dá)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)TRX1發(fā)生核轉(zhuǎn)運(yùn)。干擾TIGAR表達(dá)對(duì)正常腦膠質(zhì)細(xì)胞的放射敏感性無顯著影響，并且干擾TIGAR表達(dá)可能增加膠質(zhì)瘤的放療敏感性。
[Abstract]:Objective : To interfere with the expression of TP53 - induced glycolytic and apoptosis - regulated proteins in human glioma cells , but the mechanism remains unknown .
To compare the difference of the function between the glioma cells and the normal glial cells , the possibility of the ADAR as the target for radiotherapy of glioma was discussed .
Finally , by establishing the in - situ implantation model of human glioma nude mice , the mechanism for regulating the radiosensitivity of human glioma cells was demonstrated .

Methods : Western blot was used to detect the effect of ionizing radiation on the expression level and p53 protein level .
The transcription level was changed by real - time fluorescence quantitative PCR ( RT - PCR ) .
pcDNA3 . 1 - 4 AR was constructed transiently by siRNA interfering with grade 4 AR expression .
Flow cytometry was used to detect the redox level of cells before and after ionizing radiation .
By transfection of the wild type TRX1 overexpression plasmid ( pcDNA3.1 - WT - TRX1 ) and the mutant TRX1 overexpression plasmid ( pcDNA3.1 - MT - TRX1 ) , the wild - type and mutant TRX1 stably expressing cell lines were obtained by G418 selection ;
cloning and forming test to detect the clone survival rate of the cells after ionizing radiation ;
The repair level of DNA damage in glioma cells at different time points ( 0.5 -12h ) after ionizing radiation was evaluated by immunofluorescence technique .
Western blot was used to detect the effect of the expression on TRX1 nuclear translocation .
The oxidation - reduction level of TRX1 protein before and after ionizing radiation was detected by oxidation - reduction Western blot .
Gene therapy was carried out by in situ injection of the slow virus , and the therapeutic effect of gene therapy combined with radiotherapy was evaluated by nuclear magnetic resonance imaging ( MRI ) .

Results : ( 1 ) In A172 cells of wild type human glioma after ionizing radiation , the expression level in A172 cells began to increase at 1 h after irradiation , and then returned to the basal level at 8h after irradiation .
The results showed that TRX1 could not inhibit TRX1 nuclear transport in glioma cells . The results showed that TRX1 could not inhibit TRX1 in glioma cells . ( 5 ) The expression of TRX1 could not change the radiosensitivity of normal brain glioma cells . However , after ionizing radiation , TRX1 nuclear transport could not be inhibited in astrocytes .

Conclusion : It is suggested that TRX1 nuclear transport induced by ionizing radiation can be significantly inhibited in human glioma cells . This phenomenon is probably related to the radiosensitivity mechanism which interferes with the expression of TRX1 in human glioma cells .

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.41;R730.55

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本文編號(hào)：1882885