本文選題：聚焦超聲　切入點(diǎn)：載MTX超聲微泡　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：聚焦超聲是使用體外聚焦超聲能量來(lái)源的一種非侵入性的技術(shù),這項(xiàng)技術(shù)首先由Lynn提出，其發(fā)展至今已經(jīng)歷了50多年的歷程。聚焦超聲主要是通過(guò)與皮膚耦合，準(zhǔn)確定位目標(biāo)組織，使焦點(diǎn)區(qū)域的組織溫度迅速升高，幾秒內(nèi)可達(dá)60℃甚至更高，因此使靶區(qū)組織由于大量熱能沉積而發(fā)生蛋白質(zhì)凝固、破壞，導(dǎo)致凝固性壞死。目前，聚焦超聲技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床，然而，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)聚焦超聲的應(yīng)用存在一定的局限性。首先，當(dāng)靶組織位置深，體積大、血供豐富時(shí)，伴隨距離的增加、血流的影響，能量會(huì)產(chǎn)生衰減。另外，聚焦超聲治療時(shí)兩個(gè)損傷區(qū)域會(huì)相互干擾。而超聲微泡造影劑能夠有效改變靶向區(qū)域的聲環(huán)境，提高聚焦超聲的療效。載藥超聲靶向微泡是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，，目前已制備出納米級(jí)微泡。近年來(lái)聚焦超聲聯(lián)合載藥超聲微泡對(duì)實(shí)體腫瘤治療的研究與臨床應(yīng)用已廣泛開展。 胎盤的發(fā)育過(guò)程中滋養(yǎng)細(xì)胞扮演了重要的角色。胚胎的滋養(yǎng)層細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性驚人地相似，其通過(guò)侵入子宮而將胚胎粘附于子宮內(nèi)膜上，再侵入血管內(nèi)皮使母體血管重建，從而開啟胎盤的血流供應(yīng)，但與腫瘤浸潤(rùn)不同的是滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲受到嚴(yán)格的時(shí)空調(diào)控。通過(guò)這一調(diào)控，人類正常的滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲僅限于子宮內(nèi)膜及淺肌層的1/3。而胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的異常侵襲則導(dǎo)致了臨床上多種疾病的發(fā)生，如胎盤植入、侵襲性葡萄胎、絨癌、胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤等。 本實(shí)驗(yàn)中，我們成功制備了載MTX超聲微泡，并對(duì)其特性進(jìn)行了檢測(cè)；通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，研究聚焦超聲與載MTX超聲微泡對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞和孕鼠胎盤的影響以及相關(guān)作用機(jī)制，以此來(lái)探討將聚焦超聲與載MTX超聲微泡聯(lián)合應(yīng)用到滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)疾病中的理論基礎(chǔ)及可行性。本研究為構(gòu)建一種新型的藥物劑型提供了新策略，也為臨床上滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)疾病的治療提供了新方向。本課題主要包括以下三個(gè)部分： 第一部分載MTX超聲微泡制備及一般特性研究 目的制備一種載MTX超聲微泡并檢測(cè)其物理特性，評(píng)估作為一種新型超聲造影劑攜帶藥物的方式。 方法采用雙乳化法法制備載MTX超聲微泡，測(cè)定其濃度、粒徑分布范圍、包封率、電位以及載藥量等特性；觀察60COγ射線滅菌前及滅菌后微泡特性的差異，觀察不同儲(chǔ)存條件下微泡特性的改變；同時(shí)檢測(cè)超聲照射后載藥微泡內(nèi)藥物的釋放。 結(jié)果載MTX微泡的濃度為1.7×109～2.3×109／ml；粒徑分布范圍為368.7～619.6nm，平均粒徑為521.4nm，單純微泡濃度為3.4×109～4.1×109／ml；微泡的包封率高于40%，載藥量高于4.0%；Zeta電位-(8.2±6.65)mV；60COγ射線滅菌前及滅菌后微泡特性無(wú)顯著差異，微泡在4℃、-20℃儲(chǔ)存7天后特性有所改變；使用超聲輻照微泡溶液后，藥物可釋放。 結(jié)論本實(shí)驗(yàn)成功制備了載MTX超聲微泡，其粒徑均勻、包封率較高、性質(zhì)穩(wěn)定，超聲輻照后可以使微泡破裂，促使超聲微泡中的藥物釋放。 第二部分載MTX超聲微泡聯(lián)合超聲靶向微泡破裂對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的研究人HTR-8滋養(yǎng)細(xì)胞株的體外培養(yǎng)條件及甲氨蝶呤體外治療的適宜濃度，以此探討載MTX超聲微泡聯(lián)合超聲靶向微泡破裂對(duì)人HTR-8滋養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、增殖抑制、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用及其相關(guān)蛋白和基因表達(dá)水平的影響。 方法體外培養(yǎng)人HTR-8滋養(yǎng)細(xì)胞，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)，CCK-8試劑盒檢測(cè)生長(zhǎng)特性，繪制生長(zhǎng)曲線。CCK-8法檢測(cè)不同濃度MTX對(duì)人HTR-8滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖抑制率，并確定適宜的MTX體外作用濃度。實(shí)驗(yàn)分為6組：對(duì)照組（C）、單純微泡+超聲組(PM+US)、載MTX微泡組(MMTX)、單純藥物組(MTX)、藥物+超聲組(MTX+US)、載藥微泡+超聲組(MMTX+US)。CCK-8法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各組人HTR-8滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖抑制率；Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組人HTR-8滋養(yǎng)細(xì)胞體外侵襲能力；Annexin V-FITC熒光染色檢測(cè)6組細(xì)胞的凋亡情況；WesternBlotting法和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Bcl-2、Bax、TIMP-1和MMP-9在蛋白和基因水平的表達(dá)情況。 結(jié)果在人HTR-8滋養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中，確定最佳接種濃度為1×105個(gè)/ml。應(yīng)用一定濃度MTX可以抑制人HTR-8滋養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈明顯濃度-時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。MMTX+US組在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)HTR-8細(xì)胞的增殖抑制作用均明顯強(qiáng)于其它各組，其增殖抑制率與其它各組相比差異均有顯著性(P0.01)。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移率，結(jié)果顯示MMTX+US組的細(xì)胞遷移率明顯低于其他各組(P 0.01)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，MMTX+US組細(xì)胞凋亡率明顯高于其它各組(P0.01)。MMTX+US組Bax和TIMP-1的蛋白和基因表達(dá)水平明顯高于其它組，而Bcl-2和MMP-9的蛋白和基因表達(dá)水平明顯低于其它各組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。 結(jié)論MTX對(duì)人HTR-8滋養(yǎng)細(xì)胞有增殖抑制作用，確定MTX的后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度為1×10-9mol/L。載MTX超聲微泡聯(lián)合超聲靶向微泡破裂對(duì)人HTR-8滋養(yǎng)細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡與侵襲相關(guān)的多個(gè)蛋白和基因的表達(dá)水平。 第三部分聚焦超聲聯(lián)合載MTX超聲微泡對(duì)孕鼠胎盤作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的探討聚焦超聲聯(lián)合載MTX超聲微泡對(duì)孕鼠胎盤的作用及相關(guān)機(jī)制。 方法90只妊娠SD大鼠隨機(jī)分為6組：對(duì)照組（C）、單純微泡+超聲組(PM+US)、載MTX微泡組(MMTX)、單純藥物組(MTX)、藥物+超聲組(MTX+US)、載藥微泡+超聲組(MMTX+US)。孕19d進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組孕鼠尾靜脈注射生理鹽水2ml；載MTX微泡組尾靜脈注射含MTX1mg的載藥微泡2ml；單純藥物組尾靜脈注射2ml MTX（含MTX1mg），三組均開腹暴露10min后關(guān)腹。其余三組孕鼠尾靜脈注射相應(yīng)物質(zhì)后30s均采用重慶海扶技術(shù)有限公司研制的海極星超聲波治療儀進(jìn)行輻照，10min后關(guān)腹。24h后開腹取出胎盤組織，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組胎盤組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax、TIMP-1、MMP-9的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)各組胎盤的細(xì)胞凋亡，Western Blotting法檢測(cè)各組孕鼠胎盤組織中Caspase-3、Bcl-2、Bax、TIMP-1、MMP-9蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Caspase-3、Bcl-2、Bax、TIMP-1、MMP-9m RNA的相對(duì)表達(dá)水平。 結(jié)果(1)各組胎盤組織中均有Caspase-3、Bcl-2、Bax、TIMP-1、MMP-9的表達(dá)。Bcl-2、MMP-9MMTX+US組表達(dá)最弱，Caspase-3、Bax和TIMP-1在MMTX+US組表達(dá)最強(qiáng)，且差異均有意義(P0.01)。(2)各組細(xì)胞凋亡指數(shù)比較，MMTX+US組最高，且與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(3) Bcl-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平對(duì)照組最高，而MMTX+US組最低，與其他各組差異明顯(P0.01)；Caspase-3、Bax、TIMP-1蛋白表達(dá)水平MMTX+US組表達(dá)最高，且與其他組比較差異顯著(P0.01)。(4) Bcl-2、MMP-9m RNA表達(dá)水平MMTX+US組最低，且與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；MMTX+US組Caspase-3、Bax、TIMP-1m RNA表達(dá)水平則最高，且與其他組比較差異顯著(P0.01)。 結(jié)論聚焦超聲聯(lián)合載MTX超聲微泡可以使孕鼠胎盤細(xì)胞的凋亡增加，抑制其增殖能力。其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡與侵襲相關(guān)的多個(gè)蛋白和基因的表達(dá)水平。為胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)疾病治療提供了理論支持及新的方向。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R445.1;R714

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 茹翱;田新橋;;超聲靶向微泡造影劑及其主要研究進(jìn)展[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2012年05期

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本文編號(hào)：1702069